تقييم الضعف الحركي في نماذج C. ايليجانس باستخدام مقايسة الحركة الشعاعية

الملخص

المصدر: Currey، H. N.، et al. تقييم الضعف الحركي في C. ايليجانس نماذج التصلب الجانبي الضموري. J. Vis. إكسب. (2021).

يوضح هذا الفيديو استخدام مقايسة الحركة الشعاعية لتقييم الخلل الحركي في C. ايليجانس يعبر عن بروتين TDP-43 البشري من النوع البري أو ALS. يسمح للديدان ذات المستويات المتفاوتة من التعبير TDP-43 من النوع البري أو المتحور بالزحف ، ويتم قياس حركتها بالمسافة الشعاعية المقطوعة من النقطة المركزية على لوحة الفحص. يميز الاختبار بين الإعاقات الحركية الخفيفة والمتوسطة والشديدة بناء على المسافة التي تقطعها سلالات C. ايليجانس.

البروتوكول

1. فحص الحركة الشعاعية

1. قم بإعداد أطباق بتري بقطر 100 مم أو 150 مم ، نصفها تقريبا مليء بوسط نمو الديدان الخيطية (NGM) ومصنفة بحديقة موحدة من بكتيريا OP50 لتغطية سطح الأجار بالكامل.
2. اقلب لوحات فحص NGM رأسا على عقب وقم بتسمية الجزء السفلي بمعرف ل C. ايليجانس السلالات المراد فحصها ، لوحين لكل سلالة (الشكل 1 أ).
3. اصنع نقطة صغيرة مع العلامة في وسط اللوحة المقلوبة (الشكل 1 أ).
4. أثناء العمل باستخدام مجهر تشريح ، انقل 15-20 ديدانا متطابقة إلى مركز لوحة الفحص مباشرة فوق النقطة المركزية (مرئية من خلال NGM) باستخدام اختيار سلك بلاتيني (الشكل 1 ب).
   ملاحظه: حاول نقل جميع الديدان في نفس الوقت أو في أسرع وقت ممكن.
   1. اضبط مؤقتا لمدة 30 دقيقة بعد وضع الديدان في وسط اللوحة. ضع الغطاء مرة أخرى على الطبق وضعه جانبا (الشكل 1 ج).
5. استمر في نقل الديدان حتى تصبح جميع السلالات على لوحات الفحص المخصصة ، مع تدوين المدة التي يستغرقها النقل بين الألواح تقريبا (استهدف ~ 1 دقيقة بين اللوحات). احتفظ بجميع اللوحات بنفس الترتيب الذي تم إعداده به.
6. بعد 30 دقيقة ، ابدأ في تسجيل اللوحة الأولى.
   1. قم بإزالة الغطاء وضع اللوحة ووجهها لأسفل تحت مجهر التشريح ، بحيث يكون الجزء الخلفي المسمى من اللوحة متجها لأعلى ، ويكون أجار NGM بين خط الرؤية والديدان. ستكون اللوحة مقلوبة عن الاستخدام العادي.
   2. اضبط تركيز المجهر حتى تظهر الديدان من خلال الأجار.
   3. باستخدام قلم طرف ملون مختلف من النقطة المركزية ، ضع نقطة صغيرة في موقع كل دودة - اتبع مسارات الدودة عبر العشب البكتيري للعثور على الأكثر بعدا.
   4. تحقق من حافة اللوحة حيث قد ينتهي الأمر ببعض الديدان هناك. أيضا ، قم بحساب وتسجيل عدد الديدان في نقطة النقطة المركزية (الشكل 1 د).
7. استمر في وضع علامة على جميع لوحات الفحص بالترتيب ، بحيث يكون لجميع اللوحات 30 دقيقة من وقت النشاط ، مع الحرص على حساب الوقت المستغرق لإعداد اللوحة. بعد ذلك، قم بإجراء قياسات يدوية أو رقمية كما هو موضح في الخطوتين 1.8 أو 1.9.
8. قم بإجراء القياسات اليدوية باستخدام المسطرة.
   1. استخدم مسطرة لقياس المسافة من نقطة المركز إلى علامات الموقع النهائية لكل دودة بالملم وتسجيل المسافة. للمساعدة في تتبع التقدم أثناء تسجيل النقاط ، قم بتسمية النقطة المسجلة الأولى بخط تمييز صغير.
   2. سجل بيانات الطول لكل نقطة على التوالي عن طريق تدوير اللوحة في اتجاه عقارب الساعة (الشكل 1E).
9. قم بإجراء القياس الرقمي باستخدام ماسح ضوئي و ImageJ.
   1. باستخدام ماسح ضوئي مسطح، امسح الجزء الخلفي من لوحة (لوحات) الفحص بجوار المسطرة (الأرقام التي تواجه سطح المسح) (الشكل 2 أ).
   2. افتح صورة اللوحة الممسوحة ضوئيا في ImageJ أو برنامج مشابه.
      ملاحظه: ImageJ هو برنامج معالجة صور مجاني قائم على Java تستضيفه المعاهد الوطنية للصحة.
   3. انقر فوق أداة الخط المستقيم ثم ارسم خطا يربط بين النقطتين 1 سم و 2 سم على الصورة الممسوحة ضوئيا للمسطرة (الشكل 2 ب).
      ملاحظه: سيؤدي الضغط على مفتاح الكمبيوتر Shift إلى إجبار الخط على أقرب زاوية 45 درجة.
   4. انتقل إلى قائمة التحليل واستخدمها لتعيين المقياس (تحليل | تعيين المقياس) (الشكل 2 ج).
   5. أدخل المسافة المعروفة (10) ووحدات الطول (مم) في المربعين المناسبين ، ولا تضبط المسافة بعدد البكسل. تحقق من Global لتطبيق نفس المقياس على جميع الصور التي يتم تحليلها في كل جلسة ImageJ ؛ خلاف ذلك ، قم بتعيين مقياس كل صورة عند الفتح (الشكل 2 د). انقر فوق OK.
      ملاحظه: تنفذ الخطوات 1.9.2-1.9.5 لضبط مقياس القياس. ستربط قياسات هذه الصورة الآن تلقائيا طول الخطوط بعلاقة البكسل: الطول المحددة. سيكون للصور الممسوحة ضوئيا بدقة 300 نقطة في البوصة علاقة تقريبية تبلغ 11.8 بكسل لكل مم.
   6. استخدم أداة فرشاة الرسم لتمييز أعلى النقطة الأولى التي سيتم تسجيلها مباشرة.
      ملاحظه: هذا مؤشر مرئي لأول دودة تم تسجيلها.
   7. استخدم أداة الخط المستقيم لرسم خط من النقطة المركزية إلى نقطة البيانات الدودية الأولى.
   8. انقر فوق المفتاح M على لوحة المفاتيح لقياس المسافة. بدلا من ذلك ، انتقل إلى قائمة التحليل واختر القياس (تحليل | قياس). في كلتا الحالتين ، سيظهر القياس في نافذة جديدة ؛ ستقوم هذه النافذة بجمع جميع القياسات لكل صورة.
   9. مع الحفاظ على نقطة المركز ثابتة، حرك نهاية الخط الذي يلامس النقطة المتنقلة الأولى إلى النقطة المتنقلة التالية، مع التحرك في اتجاه عقارب الساعة، وانقر فوق المفتاح M للقياس.
   10. استمر في قياس كل نقطة في اتجاه عقارب الساعة حتى يتم تسجيل جميع النقاط.
   11. انسخ بيانات قياس الطول ولصقها في جدول بيانات لحفظها. ثم كرر العملية لكل صورة لوحة ممسوحة ضوئيا.
       ملاحظه: تقيس الخطوات 1.9.6 - 1.9.11 قيم إزاحة الدودة (الشكل 2E-F).
10. إجراء التحليل الإحصائي.
    1. اجمع التكرارات في تجربة واحدة بحيث يتراوح العدد الإجمالي الذي تم تسجيله بين 30-40 دودة.
    2. قم بإجراء عمليات مكررة تجريبية مستقلة في أيام مختلفة ومع مجموعات مستقلة من الديدان لينتهي بها الأمر ب 3 تكرارات تجريبية مستقلة.
    3. تحليل البيانات باستخدام التحليلات الإحصائية المناسبة مثل اختبار Student's t لسلالين أو ANOVA أحادي الاتجاه لثلاث سلالات أو أكثر.

النتائج

الشكل 1: سير عمل فحص الحركة الشعاعية. تظهر اللوحات A-E الخطوات المعممة لمقايسة الحركة الشعاعية. الخطوات هي كما يلي: (A ) يتم تحضير لوحات NGM ، مع OP50 المصنف على الحواف ، عن طريق وضع العلامات على النقطة المركزية وتمييزها ، (B ) يتم وضع الديدان في وسط الأجار كما هو موضح بالنقطة المركزية ، (C ) يسمح للديدان بالتحرك بحرية لفترة زمنية م...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
C. elegans	مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC)	-	احصل على سلالات القراءة حسب الرغبة ، N2 هي سلالة تحكم مفيدة
ماصات باستور يمكن التخلص منها ، زجاج البورسليكات	VWR	14673-010	تستخدم الماصة الزجاجية لإنشاء معول دودي - أمسك ماصة زجاجية بيد واحدة و ~ 1 بوصة من الأسلاك البلاتينية (مثبتة بواسطة كماشة) في الأخرى فوق اللهب للانضمام.
أطباق بتري يمكن التخلص منها، 35 × 10 مم	VWR	10799-192	لوحات الفحص لنظام التصوير WormLab
أطباق بتري يمكن التخلص منها، 60 × 15 مم	VWR	25384-090	لوحات مخزون للديدان
أطباق بتري يمكن التخلص منها، 100 × 15 مم	VWR	25384-302	لوحة فحص الحركة الشعاعية القياسية
أطباق بتري يمكن التخلص منها، 150 × 15 مم	VWR	25384-326	لوحة فحص الحركة الشعاعية ذات الإطار الزمني الأطول
تشريح المجهر	لايكا	M80	مجال الحفاظ على الديدان وإعداد فحوصات الحركة الشعاعية
علامات ذات رؤوس دقيقة	VWR	52877-810	تحتاج إلى 2 ألوان على الأقل لمقايسات الحركة الشعاعية. نصائح دقيقة مطلوبة للدقة.
ماسح ضوئي مسطح	أمازون	Epson Perfection V850	اختياري لمقايسة الحركة الشعاعية. يفترض البروتوكول دقة 300 نقطة في البوصة ، ومعظم الماسحات الضوئية ستعمل بشكل جيد
NGM (وسط نمو الديدان الخيطية)	VWR	76347-412	وسط يستخدم لزراعة C. ايليجانس. يمكن صنعه من الصفر ، انظر WormBook: صيانة C. elegans
بكتيريا OP50	مركز علم الوراثة لالتهاب كينورهابديت (CGC)	OP50	مصدر الغذاء الأساسي ل C. ايليجانس
P1000 ماصة	VWR	76207-552	الماصة المستخدمة في فحص السباحة
p1000 نصائح	VWR	83007-384	نصائح لجهاز ماصة ، تستخدم في فحص السباحة
سلك بلاتيني ، قطر 0.2032 مم	VWR	BT136585-5M	سلك بلاتيني دقيق يستخدم لإنشاء معول دودي - أمسك ماصة زجاجية في يد واحدة و ~ 1 بوصة من الأسلاك البلاتينية (التي تمسك بها كماشة) في الطرف الآخر فوق اللهب للانضمام.
المسطرة	VWR	56510-001	تحتاج إلى تسجيل فحوصات الحركة الشعاعية
ImageJ	المعاهد الوطنية للصحة	-	البرمجيات الحرة الاختيارية المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة - https://imagej.nih.gov/ij/
نظام التصوير WormLab	MBF العلوم البيولوجية	WormLab	يتضمن نظام التصوير أجهزة WormLab (مجال ساطع المسرح والكاميرا والمبيت) وبرنامج WormLab. https:// www.mbfbioscience.com/wormlabimaging- النظام