التهجين في الموقع باستخدام مجسات قليل النوكليوتيدات لدراسة تعبير الحمض النووي الريبي في أقسام دماغ الفئران

الملخص

المصدر: Shokry, I. M., et al. التهجين السريع في الموقع باستخدام مجسات قليل النوكليوتيدات على دماغ الفئران المصابة بمتلازمة السيروتونين المسبقة ببارافورمالديهايد. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو الكشف عن تخليق الحمض النووي الريبي لمستقبلات السيروتونين باستخدام مجسات قليل النوكليوتيدات في أنسجة دماغ الفئران المتأثرة بمتلازمة السيروتونين. يتضمن البروتوكول المعالجة المسبقة للأنسجة ، وتهجين المسبار ، والكشف الأنزيمي لتصور وتحديد تعبير الحمض النووي الريبي لمستقبلات السيروتونين تحت المجهر.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< p class = "jove_title" >1. التحضير

1. تحضير الأنسجة وتقسيمها
   1. قم بتعيين الفئران بشكل عشوائي إلى ثلاث مجموعات: طازجة / ملحية (SAL ؛ 0.9٪ كلوريد الصوديوم) ، مسبوقة / SAL وبادئة / 3،4-ميثيلين ديوكسي ميثامفيتامين (MDMA ؛ انظر التفاصيل في الجدول 1).
   2. يجب تطبيق ثلاث جرعات من 1 مل/كغ من محلول الثدي السلبي و10 ملغ/كغ من MDMA داخل الصفاق على التوالي لفئتي SAL و MDMA بفاصل ساعتين. اسمح للحيوانات بالبقاء على قيد الحياة من العلاج لمدة 6 أيام.
   3. في اليوم 7 ، يتم إعطاء 100 مجم / كجم من الكيتامين بتركيبة من 5 مجم / كجم زيلازين داخل الصفاق للفئران لإجراء تخدير عميق (أي فقدان وميض القرنية وردود الفعل قرصة الذيل).
   4. بالنسبة لمجموعة الطازجة / SAL ، قم بقطع رأس الفئران بسرعة وإزالة الدماغ لاختبار الدماغ الجديد.
   5. بالنسبة للمجموعات المسبوقة / SAL والبادئة / MDMA ، قم بعمل قطع على طول القص حوالي 10-12 سم ثم كشف نهاية القص.
   6. أمسك نهاية القص بإرقاء وقطع الحجاب الحاجز بشكل جانبي على كلا الجانبين بمقص حاد ثم اقطع لأعلى عبر الأضلاع وبالتوازي مع الرئتين.
   7. بيد واحدة ، أمسك الطرف البطني للقلب بملقط صغير. من ناحية أخرى ، اخترق البطين الأيسر بإبرة حقنة 18 G (لاحظ أن جانب المحول من الإبرة متصل بخرطوم سيليكون على شكل حرف Y إلى SAL المثلج وحاويات بارافورمالدهايد والمضخات التمعجية).
   8. قم بتشغيل مضخة SAL عند المستوى المتوسط لمعدل التدفق (~ 5 مل / دقيقة) وثقب الأذين الأيمن بالملقط للسماح بالهروب من دوران العودة. حافظ على نضح SAL لمدة 30 دقيقة.
   9. قم بتشغيل مضخة بارافورمالدهايد على المستوى المتوسط واترك المثلج البارد بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد بنشر لمدة 30 دقيقة.
   10. قم بإزالة أداة التروية وقطع رأس. قم بعمل قطع خلفي أمامي عبر خط الوسط للجمجمة ، ثم قم برفرفة الجمجمة لفضح تجويف الجمجمة.
   11. قم بإزالة الدماغ بملعقة من تجويف الجمجمة وضع الدماغ في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل يحتوي على 25 مل من 4٪ بارافورمالدهايد. احتفظ بالدماغ داخل الأنبوب المحتوي على بارافورمالديهايد في الثلاجة 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.
   12. انقل الدماغ إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل يحتوي على 25 مل من محلول السكروز بنسبة 30٪ عند 4 درجات مئوية لمدة 3 أيام. أخيرا ، قم بتخزين الدماغ داخل أكياس بلاستيكية عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
   13. قم بتركيب الدماغ على ظرف مع وسائط التضمين وقم بتجميد وسائط التضمين التي تحتوي على الدماغ في ناظم البرد عند درجة حرارة -26 درجة مئوية. قم بتقطيع الدماغ المجمد الطازج إلى أقسام 20 ميكرومتر والدماغ المسبوق ببارافورمالديهايد إلى أقسام 10 ميكرومتر. انقل القسم إلى شريحة مجهر درجة حرارة الغرفة (RT) عن طريق لمس الشريحة إلى القسم.
   14. يجفف في الهواء عند RT لمدة 4 ساعات. قم بتخزين شرائح القسم في كيس محكم الغلق عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. تجفاف
   1. خذ شرائح من الفريزر -80 درجة مئوية وقم بتعيين أقسام في واحد من ثلاثة اختبارات: جين مستقبلات السيروتونين 5-HT_2A (ht2a) ، ppiB (جين الببتيديل بروليل إيزوميراز B ، التحكم الإيجابي) أو dapB (جين اختزال ثنائي هيدروديبيكولينات البكتيري ، التحكم السلبي) ؛ ضع علامة على الأقسام وتسميتها بقلم كرة (لا تستخدم قلم رصاص). اغمر الشرائح في كحول 100٪ في RT لمدة 5 دقائق. جفف الشرائح لمدة 5 دقائق في غطاء الدخان.
3. المعالجه المسبقه
   1. ماصة 20 ميكرولتر من كاشف المعالجة المسبقة -1 (تعطيل الفوسفاتيز القلوي) إلى الأقسام الموجودة على الشرائح. ضع الشرائح على سكة رف في صينية رطوبة (لاحظ أن الدرج مغطى بغطاء للحفاظ على رطوبة عالية لمنع التبخر من محلول التفاعل).
   2. رج صينية الرطوبة برفق على شاكر أفقي بسرعة منخفضة لمدة 10 دقائق. اغسل الشرائح مرتين بالماء المقطر المزدوج (ddH₂O) لمدة دقيقتين. اغمر الشريحة في دورق سعة 200 مل يحتوي على 150 مل من كاشف المعالجة المسبقة -2 (كسر الروابط المتقاطعة الناجمة عن تثبيت بارافورمالدهايد). قم بغلي الشرائح لمدة 5 دقائق عند 100 درجة مئوية (استعادة بنية الحمض النووي الريبي الناجمة عن الحرارة).
   3. اغسل الشرائح مرتين باستخدام ddH₂O لمدة دقيقتين ، ضع الشرائح في كحول 100٪ لمدة 5 دقائق ، جفف الشرائح لمدة 5 دقائق في غطاء الدخان. استخدم قلما كارها للماء لرسم دائرة حول المنطقة المحددة في قسم الأنسجة (على سبيل المثال ، الهياكل غير القشرية ، بما في ذلك المهاد وما تحت المهاد كما هو موضح في الشكل 1).
   4. الماصة 10 ميكرولتر من كاشف المعالجة المسبقة -3 (زيادة في اختراق المسبار) إلى كل منطقة محددة وتغطية صينية الرطوبة بالغطاء. ضع الصينية في فرن التهجين المزود بشاكر أفقي واضبط درجة حرارة الفرن على 40 درجة مئوية ؛ رج الصينية برفق لمدة 30 دقيقة. اغسل الشرائح مرتين باستخدام ddH₂O لمدة دقيقتين.

< p class = "jove_title" >2. التهجين والتضخيم

1. الماصة 10 ميكرولتر من كواشف المسبار htr2a و ppiB و dapB ، على التوالي ، في المناطق المختارة. قم بتغطية صينية الرطوبة بالغطاء لمنع تبخر الكاشف. رج العبوة برفق على الخلاط الأفقي على سرعة منخفضة. احتضن الشرائح عند 40 درجة مئوية في الفرن لمدة ساعتين.
2. اغسل الشرائح مرتين باستخدام مخزن مؤقت للغسيل لمدة دقيقتين ، ماصة 10 ميكرولتر من كاشف Amplification-1 في كل منطقة محددة ، رج الشرائح واحتضانها عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
3. اغسل الشرائح مرتين باستخدام مخزن مؤقت للغسيل لمدة دقيقتين.
4. اغسل الشرائح مرتين باستخدام مخزن مؤقت للغسيل لمدة دقيقتين.
5. اغسل الشرائح مرتين باستخدام مخزن مؤقت للغسيل لمدة دقيقتين ، ماصة 10 ميكرولتر من كاشف Amplification-4 في كل منطقة محددة ، رج الشرائح واحتضانها عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
6. اغسل الشرائح مرتين باستخدام مخزن مؤقت للغسيل لمدة دقيقتين ، ماصة 10 ميكرولتر من كاشف Amplification-5 في كل منطقة محددة ، وقم بهز الشرائح واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة.
7. اغسل الشرائح مرتين باستخدام مخزن الغسيل لمدة دقيقتين ، ماصة 10 ميكرولتر من كاشف Amplification-6 في كل منطقة محددة ، وقم بهز الشرائح واحتضانها في RT لمدة 15 دقيقة.

3. كشف الإشارة

1. الماصة 10 ميكرولتر من الكاشف الأحمر لكل منطقة محددة (لاحظ أن الكاشف عبارة عن خليط من Red-B و Red-A بنسبة 1:60 ويجب استخدامه على الفور). ضع الشريحة في درج الرطوبة على الخلاط الأفقي عند RT ورجها برفق بسرعة منخفضة لمدة 10 دقائق.
2. اغسل الشرائح مرتين باستخدام (ddH₂O) لمدة 10 دقائق. جفف الشرائح على حرارة 60 درجة مئوية في الفرن لمدة 15 دقيقة. ضع الشرائح في الزيلين تحت غطاء الدخان لمدة 5 دقائق.

النتائج

الجدول 1. التصميم التجريبي

	طازج	Paraformaldehyde-prefixeda
	SALb	SALb	MDMAc
مسبار الهدف (htr2a)	√	√	√
مسبار إيجابي (ppiB)	–

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مسبار التحكم السلبي RNAscope-DapB	تشخيص الخلايا المتقدمة ، INC	310098
RNAscope Pretreat 4	تشخيص الخلايا المتقدمة ، INC	320046
مجموعة كاشف RNAscope 2.0 HD - أحمر	تشخيص الخلايا المتقدمة ، INC	310036
مسبار RNAscope - Rn-PPIB	تشخيص الخلايا المتقدمة ، INC	313921
الجرذ Htr2a	تشخيص الخلايا المتقدمة ، INC	300031
Cryostat	لايكا	CM 1850
شاكر أفقي	VWR	88032-088
فرن التهجين	ثيرمو فيشر العلمي	22000
شريحة مجهر Superfrost Plus	فيشر العلمي	12-550-15
قلم مسعور	المتجه	H-4000
مجهر	أوليمبوس	بروفيس AX70