تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.
< p class = "jove_title" >
1. تقطيع الدماغ
- قم بتوجيه العينة بحيث يكون الجانب الظهري من المخيخ على الجانب الأمامي. صب القطع المثلج ACSF (السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي) ، الذي يحتوي على 1 ميكرومتر TTX (Tetrodotoxin) ، وهو ما يكفي لغمر المخيخ تماما. ضع أنبوب غاز في ACSF وابدأ في الفقاعات بخليط الغاز O2 / CO2.
- قم بإزالة الأم العنكبوتية باستخدام ملاقط دقيقة تحت منظار. اقطع السويقة المخيخية بشفرة ، وقم بإزالة جذع الدماغ وكتلة أجار. قم بتدوير الدرج 180 درجة ، بحيث يواجه السطح الظهري للمخيخ شفرة حلاقة.
- اضبط الشفرة واضبط موقع القطع الأول. اضبط معلمات تقطيع الاهتزاز على ما يلي: السعة إلى 5.5 ، والتردد إلى 85 هرتز ، والسرعة إلى 3-4 ، وسمك الشريحة إلى 300 ميكرومتر.
- انقل شريحة المخيخ على شبكة نايلون إلى حاضنة أكريليك واغمر الشريحة بالكامل في ACSF المؤكسج. يجب وضع الحاضنة في حمام مائي يحافظ على درجة حرارة 26 درجة مئوية.
- قم بتخزين الشرائح لمدة 1 ساعة على الأقل للسماح بالتعافي من التلف أثناء التقطيع.
2. تسجيل مشبك التصحيح للخلية الكاملة
ملاحظة: يتطلب تسجيل مشبك التصحيح المعدات التالية: مجهر عمودي مع بصريات تباين التداخل التفاضلي بالأشعة تحت الحمراء (IR-DIC) ، ومكبر صوت مشبك التصحيح ، ومحول رقمي للبيانات ، ومحفز رقمي ، وعازل ، وكمبيوتر ، وبرنامج للحصول على البيانات وتحليلها ، ومناور آلي ، ومنصة مجهر ، وطاولة عزل الاهتزاز ، وقفص فاراداي ، ونظام تسخين المحلول ، والمضخات التمعجية ، ومجتذب القطب.
- أضف بيكروتوكسين (0.1 مليمتر) إلى ACSF وحلها باستخدام الموجات فوق الصوتية لمدة 3 دقائق.
قم - بتعبئة غرفة التسجيل ب ACSF المشبع بالبيكروتوكسين بمعدل 2 مل / دقيقة.
- قم بعمل قطب تسجيل عن طريق سحب الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات بخيوط (القطر الخارجي = 1.5 مم) باستخدام مجتذب ب 4 خطوات. يجب أن يكون قطر الطرف حوالي 1 ميكرومتر.
- اصنع قطبا كهربائيا محفزا عن طريق سحب نفس الشعيرات الدموية باستخدام المجتذب بخطوتين ، ثم اكسر لإنتاج طرف رفيع عن طريق ضرب الطرف على كتلة حديدية تحت مجهر مجهر. يجب أن يكون القطر النهائي 3-5 ميكرومتر.
- انقل شريحة المخيخ إلى غرفة التسجيل وثبتها بوزن Pt بخيوط من النايلون. املأ قطبا كهربائيا محفزا باستخدام ACSF.
- لتحفيز PFs ، ضع القطب المحفز على سطح الطبقة الجزيئية ، على بعد حوالي 50 ميكرومتر من طبقة خلية بركنجي.
- لتحفيز التليف الكيسي ، ضع القطب المحفز في الجزء السفلي من طبقة خلية بركنجي (الخطوتين 3.3 ، 3.4).
- قم بتصفية الحل الداخلي المستند إلى K+ أو Cs + باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر. استخدم محمل دقيق لملء قطب تسجيل ب 8 ميكرولتر من المحلول الداخلي.
- قم بتطبيق ضغط إيجابي ضعيف على قطب التسجيل قبل غمره في ACSF. يجب أن تكون مقاومته 2-4 MΩ ويجب تصحيح إمكانات التوصيل السائل.
- اقترب من جسم الخلية السليم والمشرق للكمبيوتر باستخدام قطب التسجيل. ادفع سطح خلية بركنجي قليلا ، وتوقف عن الضغط الإيجابي ، ثم قم بالضغط السلبي حتى تشكيل ختم جيجا أوم. ثم قم بإنشاء تكوين الخلية بأكملها باستخدام الضغط السلبي.
- احتفظ بإمكانات الغشاء عند -70 مللي فولت ، وقم بتطبيق نبضة -2 مللي فولت (المدة ، 100 مللي ثانية) عند 0.1 هرتز لمراقبة مقاومة الإدخال ومقاومة السلسلة وسعة الإدخال ، بشكل مستمر. لا تستخدم تعويض المقاومة المتسلسلة. تجاهل البيانات عندما تختلف مقاومة السلسلة بأكثر من 15٪.
< ص الفئة = "jove_title" >
3. تحريض LTD (الاكتئاب طويل الأمد)
- تحفيز الطبقة الجزيئية بنبض (المدة ، 0.1 مللي ثانية). حدد PF (الألياف المتوازية) - التيارات المثيرة بعد المشبكي (EPSC) عن طريق تطبيق محفز نبض مزدوج (فاصل التداخل (ISI) يبلغ 50 مللي ثانية). يجب أن يظهر PF-EPSC تسهيل النبض المزدوج والزيادة التدريجية في السعة بالنسبة إلى زيادة شدة التحفيز.
- سجل استجابة اختبار PF-EPSC عن طريق تطبيق نبضة واحدة عند 0.1 هرتز. اضبط شدة المنبه بحيث تكون سعة EPSC المستحثة حوالي 200 باسكال باسكال. تجنب تلوث التيار عبر القناة الأيونية المعتمدة على الجهد.
- تحفيز التليف الكيسي في الجزء السفلي من طبقة خلية بركنجي ، وتحديد EPSC الناتج عن تنشيط التليف الكيسي (عن طريق تطبيق محفز النبض المزدوج). يجب أن يظهر CF-EPSC اكتئاب النبض المزدوج وطريقة الكل أو لا شيء وفقا للزيادة في شدة التحفيز. بالنسبة للحث المحدود ، يجب استخدام حافز واحد.
- بروتوكول LTD المحفز 1
- باستخدام قطب كهربائي يحتوي على محلول داخلي قائم على K + في ظل ظروف المشبك الحالي ، قم بتطبيق محفز PF واحد ومحفز CF واحد في وقت واحد عند 1 هرتز لمدة 5 دقائق (300 نبضة) (الشكل 1 أ).
- بروتوكول LTD المحفز 2
- باستخدام محلول داخلي يحتوي على قطب كهربائي يحتوي على K + في ظل ظروف المشبك الحالي ، قم بتطبيق محفزات PF مزدوجة (ISI من 50 مللي ثانية) ومحفز CF واحد حيث يتزامن محفز PF الثاني مع محفزات CF عند 1 هرتز لمدة 5 دقائق (الشكل 1 ب).
- بروتوكول LTD المحفز 3
- باستخدام قطب كهربائي يحتوي على محلول داخلي قائم على Cs + في ظل ظروف مشبك الجهد ، قم بتطبيق محفز PF مزدوج (ISI من 50 مللي ثانية) وخطوة جهد إزالة استقطاب واحدة (-70 إلى 0 مللي فولت ، 50 مللي ثانية) على سوما عند 1 هرتز لمدة 3 دقائق ، بحيث يكون محفز PF الثاني مكافئا لبداية خطوة جهد إزالة الاستقطاب (الشكل 1C).
- بروتوكول LTD-instruing-4
- باستخدام قطب كهربائي يحتوي على محلول داخلي قائم على Cs + في ظل ظروف مشبك الجهد ، قم بتطبيق محفزات PF (5x عند 100 هرتز) وخطوة جهد واحدة لإزالة الاستقطاب (-70 إلى 0 مللي فولت ، 50 مللي ثانية) على سوما عند 0.5 هرتز لمدة 3 دقائق ، في وقت واحد (الشكل 1D).
