مقالة منهجية

نموذج في المختبر لدراسة عبور مسببات الأمراض للحاجز الدموي الدماغي وعدوى خلايا الدماغ

956 مشاهدات

⸱

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

المصدر: da Costa, A., et al. نموذج واجهة الدم والدماغ البشري لدراسة عبور الحاجز بواسطة مسببات الأمراض أو الأدوية وتفاعلاتها مع الدماغ. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو نموذجا في المختبر لدراسة مسببات الأمراض التي تعبر الحاجز الدموي الدماغي (BBB). تشكل الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة ، التي تعبر عن تقاطعات ضيقة ، طبقة بطانية في الغرفة العلوية ، بينما تمثل الخلايا العصبية والخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة حمة الدماغ في الغرفة السفلية ، مفصولة بغشاء مسامي. تحاكي العدوى الفيروسية في نموذج BBB انتقال العامل الممرض من الدم إلى الدماغ. عند إدخال فيروس عصبي ، فإنه يعبر BBB عن طريق التحول الخلوي ، ويصيب الخلايا العصبية ، ويتكاثر ، ويطلق ذرية فيروسية ، مما يدل على الغزو العصبي الناجح.

البروتوكول

1. بناء ومراقبة جودة BBB-Minibrain (الحاجز الدموي الدماغي - الدماغ المصغر) (الشكل 1)

  1. إعداد جهاز إدراج غشاء بوليستر BBB-Minibrain ( الشكل 1 ب )
    1. قم بزراعة خط الخلايا البطانية للدماغ البشري (خلايا hCMEC / D3) على 12 بئر إدراج مرشحات غشاء البوليستر لمدة 6 أيام على وسط الخلية البطانية قبل استخدامها للتجربة.
    2. قم بتغطية صفيحة 12 بئر ببولي د-ليسين (1 مل / بئر ، 10 ميكروغرام / مل ، 4 ساعات في RT) ثم اللامينين (1 مل / بئر ، 1 ميكروغرام / مل ، بين عشية وضحاها في RT).
    3. قم بإزالة اللامينين وإضافة 1 مل من وسط الخلايا البطانية المكمل بمصل بقري الجنين 5٪ (FBS) (5٪ وسط الخلايا البطانية).
    4. احتضان لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون 2 و 95٪ رطوبة.
    5. قم بالتربسين بلطف الخلايا العصبية البشرية بعد الانقسام (hNeurons) والخلايا النجمية البشرية (hالخلايا النجمية) (NT2-N / A) وخط الخلايا الدبقية المجهرية البشرية (CHME / Cl5) وفصل كريات الخلية بوسط الخلية البطانية الكامل.
    6. عد الخلايا ، واخلط 3.6 × 10 5 NT2-N / A و 0.4 × 10 5 خلايا CHME / Cl5 / البئر وزرع لوحة 12 بئر.
    7. عند T = 24 ساعة (24 ساعة بعد البذر): قم بتغيير الوسط المستخدم بوسط خلية بطانية كاملة طازجة (خلايا الدماغ المصغر والخلايا البطانية) وانقل مرشح إدراج غشاء البوليستر hCMEC / D3 في الجزء العلوي من خلايا الدماغ الصغير. احتضان BBB-Minibrain عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 و 95٪ رطوبة.
      ملاحظة: سيتألف BBB-Minibrain بعد ذلك من طبقة من الخلايا البطانية البشرية hCMEC / D3 على مرشح يعزل الحيز اللمعي (أو حجرة "الدم") ومن ثقافة مختلطة من الخلايا البشرية hNT2-N / A و hCHME / Cl5 (الدماغ الصغير) في الجزء السفلي من البئر الذي يحدد الحيز العظمي (أو حجرة "الدماغ") ( الشكل 1 ب ).
  2. التحقق من صحة نفاذية البطانة ل BBB-Minibrain (مراقبة الجودة) (الشكل 1C)
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت للنقل (TB) ، وهو HBSS (محلول الملح المتوازن من هانكس) مع Ca 2 + و Mg 2+ مكملا ب 10 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض (HEPES) و 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم.
    2. قم بإعداد 12 لوح بئر مع 1.5 مل من عازلة النقل لكل بئر.
    3. عند T = 0 ، قم بعمل مخزن مؤقت نقل جديد مكمل ب 50 ميكرومتر لوسيفر أصفر (LY-TB).
    4. اعكس كل مرشح رأسا على عقب لإزالة الوسط بعناية دون التأثير على حاجز الخلية البطانية.
    5. ضع الفلتر على لوح 12 بئر مملوء وأضف 0.5 مل من LY-TB.
    6. احتضان الصفائح في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 و 95٪ رطوبة.
    7. عند T = 10 دقائق ، انقل المرشحات الموجودة على 12 لوحة بئر مملوءة بالسل الجديد واحتفظ بالمقصورة العظمية للوحة الأولى لقراءة OD.
    8. عند T = 25 دقيقة ، كرر الخطوة 1.2.7.
    9. عند T = 45 دقيقة ، أوقف النقل عن طريق إزالة المرشحات من الألواح. احتفظ بمقصورات اللوميعة واللومنية لتدابير OD.
    10. نقل العينات في بئر 96 مظلمة: 10 ميكرولتر مع 190 ميكرولتر تيرابايت ل LY-TB والمقصورات اللمعية ، 200 ميكرولتر من العينة للمقصورات abluminal.
    11. قم بقياس تألق السل الغسالي الموجود في العينات المختلفة عند λ428 نانومتر λ535 نانومتر (موجات طول الإثارة والانبعاث على التوالي).
    12. احسب نفاذية البطانة (Pe) نحو السل الغاضب (PeLY) باستخدام الصيغة:
      1/PSE= (1/PST) – (1/PSf) و PeLY= PSe/S.
      ملاحظة: PSf هي نفاذية المرشح بدون خلايا ، PST هي نفاذية المرشح بالخلايا ، PSe هي نفاذية الطبقة الأحادية البطانية لسطح الطبقة الأحادية ، S هو سطح الطبقة الأحادية (لمرشح 12 جيدا = 1.12 سم 2 ) ، يتم التعبير عن Pe LY بالسنتيمتر / دقيقة. بالنسبة إلى hCMEC / D3 ، يجب أن يكون Pe LY بين 0.7 و 1.2 × 10 -3 سم / دقيقة اعتمادا بشكل أساسي على FBS المستخدم في التجارب. هام: يعني PeLY أعلى من 1.2 أن BBB ليس ضيقا بدرجة كافية ويمكن ملاحظة بعض التسرب. تجاهل هذه الحواجز.

2. استخدام BBB-Minibrain لتسليط الضوء على وجود جزيئات فيروسية غازية عصبية في عينة لقاح فيروس الحمى الصفراء ، الفيروس العصبي الفرنسي ، YFV-FNV 34 (الشكل 2)

  1. عبور BBB وتكاثر فيروسات الحمى الصفراء في الدماغ المصغر
    1. استخدام BBB-Minibrain المحضر كما هو موضح في الخطوة 1.1.7 24 ساعة قبل إضافة الفيروس; استبدل الوسط ب 2٪ FBS بطانة الخلية.
      ملاحظة: من المهم للغاية تجنب تغيير الوسيط قبل إضافة الفيروس مباشرة. يمكن أن يؤدي تغيير الوسيط إلى تنشيط الخلايا البطانية البشرية وفتح الحاجز بشكل عابر مما يسمح بمرور الفيروس. هنا يتم تغيير الوسيط قبل 24 ساعة من بدء التجربة.
    2. عند T = 0 ، أضف 3500 وحدة تشكيل البلاك (PFU) من YFV-FNV المخففة في 50 ميكرولتر من وسط الخلية البطانية FBS 2٪ بعناية فائقة في الجزء العلوي من الحجرة اللمعية. يتم تلقيح وحدة التحكم BBB-Minibrain ب 50 ميكرولتر من وسط الخلية البطانية FBS 2٪ بدون فيروس. حدد PeLY على بئر الرفيق.
    3. احتضان BBB-Minibrain في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ CO 2 و 95٪ رطوبة.
    4. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة جهاز مرشح إدراج ثقافة غشاء البوليستر وحدد Pe LY ، وعينة 1 مل من حجرة abluminal ومعايرة الفيروس. استبدل الوسط بوسط خلية بطانة FBS طازج بنسبة 2٪.
    5. احتضان BBB-Minibrain عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 و 95٪ رطوبة.
    6. بعد 72 ساعة ، قم بأخذ عينات من الوسط من الحجرة العظمية ومعايرة الفيروس ، و / أو استخرج الحمض النووي الريبي من خلايا الدماغ المصغر لتحليل التعبير الجيني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

figure-results-1
الشكل 1: نموذج BBB-Minibrain. أ. الجدول الزمني لثقافات hCMEC / D3 وصورة لجهاز BBB-Minibrain: يتم تثبيت مرشح إدراج غشاء البوليستر مع الحاجز البطاني hCMEC / D3 بملقط قبل إدخاله في بئر واحد من لوحة زراعة خلايا 12 بئر. ب . رسم كاريكاتوري يصف الجهاز مع الحجرة اللمعية (الدم) التي تحتوي على حاجز الخلايا البطانية وحجرة الدماغ (الدماغ) التي تحتوي على خلايا الدماغ المصغر (الخلايا العصبية البشر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
12 لوحة بئركورنينج336
طبق بتري 85 ملمسارستيدت 83-3902-500
CHME / Cl5 Unité de Neuroimmunologie Viraleبناء على طلب إلى الدكتور لافون
CMCكالبيوكيم217274
96 لوحة بئر داكنة كورنينج3915
DMEM F12الرماد الحراري العلمي3130-038
DMSOميرك سيجما ألدريتش D2650
الإندوجرو الرابعميليبور SCME004
الإيثانولكارلو إربا529121
FBSHycloneSV30015-04 وسط الخلية البطانية
HBSS مع Ca2+-mg2+الرماشر العلمي14025-100
hCMEC/D3CedarlaneCLU512
Hepes 1Mالرصيد الحراري العلمي15630-070
لامينينميرك سيجما ألدريتش L6274
L-glutaminالرماد الحراري العلمي25030-024
لوسيفر الأصفرميرك سيجما ألدريتش L0259
MEM 10Xالرماشر العلمي 21430
MEM 1Xالرماد الحراري العلمي42360
Ntera/Cl2D.1ATCCCRL-1973
بارافورمالدهايد علوم المجهر الإلكتروني15714
PBS بدون Ca2+-Mg2+الرماشيد العلمي14190
PBS-Ca2+-Mg2+الرماد الحراري العلمي14040-091
القلم/الاسترب يوروبيوCXXPES00-07
بولي د-ليسينميرك سيجما ألدريتش P1149
إطالة الذهبالرضع الحراري العلميP36930
طقم تنقية الحمض النووي الريبيQIAGEN74104
بيكربونات الصوديوم 5.6٪ يوروبيوCXXBIC00-07
بيروفات الصوديومالرماشر العلمي11360
خلية T75 + قارورة سارستيدت83-1813-302قارورة البوليسترين لزراعة الأنسجة مع معالجة سطحية محددة (خلية +) للخلايا الملتصقة الحساسة
ترانسويلكورنينج3460إدراج ثقافة غشاء البوليستر المسامي
Trypsin-EDTAميرك سيجما ألدريتش T3924
ماء فائق النقاءالرماشيد العلمي10977-035
Verseneالرصيد الحراري العلمي15040-033EDTA
YFV-FNVIP Dakarقارورة اللقاح

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة