< p class = "jove_title" >
1. تحضير الذباب لتجارب FlpOut متعددة الألوان (MCFO)
ملاحظة: تشير تقنية MCFO إلى نسخة معدلة مما يسمى باستئصال كاسيت التوقف بوساطة Flp (FlpOut). يحمل ذباب MCFO المعدلة وراثيا محفز الصدمات الحرارية (hsp) -FLP recombinase ومراسلين مختلفين تحت التحكم في تسلسل التنشيط (UAS). يتكون كل مراسل من عمود فقري مشترك لبروتين الفلورسنت الأخضر ذو المجلد الفائق (sfGFP) ، حيث تم إدخال 10 نسخ من علامة الحاتمة (على سبيل المثال ، HA أو FLAG أو V5). تسمى البروتينات غير الفلورية الناتجة "معكرونة وحش GFPs" (smGFPs) ويمكن اكتشافها باستخدام أجسام مضادة محددة ضد علامات الحاتمة المختلفة.
- يعبر الذباب مع كاسيت MCFO و hsp-Flp (hsp-Flp ؛ 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA ، 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG ، 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) إلى خطوط تشغيل GAL4 الدبقية المناسبة (انظر جدول المواد).
- نظرا لأن hsp نشط بالفعل عند 25 درجة مئوية وقد يخضع عدد قليل من الخلايا لإعادة التركيب مما يؤدي إلى وضع علامات غير محددة ، فقم بإعداد تقاطعات عند 18 درجة مئوية لتجنب تسرب النظام. انتظر حوالي 20 يوما عند 18 درجة مئوية للحصول على جيل F1. بعد الصدمة الحرارية (انظر الخطوة 2) ، حافظ على الذباب عند 25 درجة مئوية (الشكل 1).
< ص الفئة = "jove_title" >
2. صدمة حرارية
ملاحظة: اعتمادا على موقع الإدخال ، قد تختلف كفاءة hsp-Flp ؛ لذلك ، يجب تحسين وقت الصدمة الحرارية الأمثل. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم استخدام مخزون ذبابة MCFO حيث تم إدخال hsp-Flp على الكروموسوم X (انظر جدول المواد).
- انقل ذرية الصليب في الخطوة 1.1 (ذباب الجيل F1 ، عمره 3-4 أيام) إلى قوارير جديدة تحتوي على طعام وصدمهم بالحرارة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
ملاحظه: الذباب الصغير (1-2 يوم) حساس جدا للصدمة الحرارية. انتظر 1 أو 2 يوم آخر قبل إجراء الصدمة الحرارية لتقليل معدل الوفيات الناجم عن العلاج. استخدم بعض ذباب الجيل F1 كعنصر تحكم ، بدون صدمة حرارية.
- أثناء الصدمة الحرارية ، احتفظ بالذباب في قوارير عادية مع الطعام لتقليل معدل الوفيات الناجمة عن الإجهاد. ضع الإناث والذكور في قوارير منفصلة.
- تأكد من غمر القارورة بأكملها في الماء لضمان حدوث صدمة حرارية متجانسة. استخدم صدمة من 5 إلى 8 دقائق كنقطة انطلاق مناسبة لوضع العلامات المتناثرة على الخلايا الدبقية مع العديد من خطوط تشغيل GAL4 ؛ يجب تحسين مدة الصدمة لكل سائق وتجربة (قد تكون أوقات الصدمة الحرارية أقصر أو أطول ضرورية).
- بعد الصدمة الحرارية ، ضع القوارير أفقيا على المقعد لبضع دقائق للسماح للذباب بالتعافي من الصدمة الحرارية.
ملاحظه: ليس من الضروري تغيير القوارير.
- حافظ على الذباب عند 25 درجة مئوية وقم بتشريحه (انظر الخطوتين 3 و 4) بعد يومين أو أكثر من الصدمة الحرارية للحصول على التعبير الأمثل للمراسل.
< p class = "jove_title" >
3. تحضير التشريح والحلول
- في يوم التشريح ، قم بإعداد محلول مثبت جديد في أنابيب PCR سعة 200 ميكرولتر عن طريق خلط 180 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا S2 مع 20 ميكرولتر من 20٪ بارافورمالدهيد (PFA) للحصول على محلول PFA بنسبة 2٪. حافظ على محلول التثبيت على الجليد قبل وأثناء التشريح.
أنذر: PFA سام ويجب التعامل معه بحذر.
ملاحظه: امزج 160 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا S2 مع 40 ميكرولتر من 20٪ بارافورمالدهيد (PFA) في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) سعة 200 ميكرولتر لتحضير محلول PFA بنسبة 4٪ بدلا من محلول 2٪.
- استخدم أنبوب PCR واحد لكل نمط وراثي بحد أقصى 8-10 أدمغة لكل أنبوب للحصول على نتائج تلطيخ مثالية.
- تحضير محلول غسل الدماغ للبالغين: 0.5٪ ألبومين مصل بقري ، 0.5٪ تريتون X-100 في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
ملاحظة: اعتمادا على التلوين ، قد تكون هناك حاجة إلى محلول يحتوي على 1٪ Triton X-100. يزيد التركيز العالي من Triton X-100 من تغلغل الجسم المضاد في الأنسجة ومن الضروري تلطيخ المناطق التي تقع في أعماق الأنسجة (على سبيل المثال ، المناطق المشبكية في دماغ ذبابة الفاكهة البالغ).
- تحضير محلول الحظر: 3٪ مصل ماعز عادي ، 3٪ مصل حمار عادي ، و 0.5٪ تريتون X-100 في PBS.
- يمكن تخزين محلول غسل الدماغ للبالغين ومحلول الحجب عند 4 درجات مئوية لبضعة أسابيع.
- ضع الصفيحة الزجاجية لآبار الاكتئاب العميقة على الجليد واملأ كل بئر بالمحاليل التالية: واحد يحتوي على 70٪ من الإيثانول ، والآخر مع PBS ، والآخر بوسط زراعة الخلايا S2.
< p class = "jove_title" >
4. تشريح دماغ البالغين
- ضع طبق تشريح بطول 3 سم على مسرح المجهر المجسم واملأه بوسط زراعة خلايا S2 البارد. قم بإجراء جميع عمليات التشريح في هذه الوسيلة للتأكد من بقاء الأنسجة سليمة أثناء إجراء التشريح.
ملاحظه: استخدم طبق تشريح مبطن بعدة ملليمترات من السيليكون الأسود الذي يوفر تباينا جيدا في الخلفية (في الصور) ، وحافظ على الملقط أثناء التشريح.
- تخدير الذباب من النمط الجيني المطلوب باستخدام ثاني أكسيد الكربون2.
- باستخدام الملقط ، أمسك الذبابة من الأجنحة واغسلها في الإيثانول البارد بنسبة 70٪ لمدة 30 ثانية ، ثم باستخدام PBS البارد لمدة 30 ثانية إضافية.
- انقل الذبابة إلى بئر الاكتئاب العميق المملوء بوسط زراعة الخلايا S2.
- كرر نفس الإجراء لجميع الذباب من نفس النمط الجيني واحتفظ به في وسط زراعة الخلايا S2 البارد حتى التشريح ، مما سيحافظ على الأنسجة.
ملاحظه: قم بتخدير عدد الذباب الذي يمكن تشريحه فقط في فترة زمنية تبلغ حوالي 30 دقيقة. قد تؤدي أوقات الحضانة الطويلة في وسط زراعة الخلايا S2 إلى إتلاف الأنسجة.
- أمسك الذبابة بالملقط ، وتحت المجهر المجسم ، اغمر الذبابة في وسط زراعة الخلايا S2.
- افصل الرأس عن باقي الجسم. تخلص من الجسم واحتفظ بالرأس مغمورا في وسط زراعة الخلايا S2. من المهم للغاية إمساك الرأس بالملقط طوال مدة التشريح. إذا بدأ الرأس في الطفو ، فسيكون من الصعب استعادته دون الإضرار بالأنسجة.
- ابدأ التشريح بسحب عين واحدة ، مع إمساك الرأس بملقط واحد على الأقل في جميع الأوقات. تأكد من أن طرف الملقط أسفل شبكية العين مباشرة لتجنب إتلاف الأنسجة الموجودة تحتها. اسحب العين الأخرى وابدأ في إزالة البشرة حتى يظهر الدماغ.
- قم بإزالة جميع أنسجة القصبة الهوائية وبشرة حول الدماغ حتى تبدو الأنسجة نظيفة. تأكد من إزالة جميع أنسجة القصبة الهوائية حول الدماغ للحصول على أفضل نتائج التلوين. الأنسجة جاهزة الآن للإصلاح والتلطيخ.
- حافظ على جميع الأدمغة التي تم تشريحها في وسط زراعة خلايا S2 البارد قبل نقلها إلى محلول PFA من أجل تحديد وقت خطوة التثبيت.
< ص الفئة = "jove_title" >
5. تلطيخ دماغ البالغين
- انقل الدماغ المعزول باستخدام ماصة P10 إلى محلول PFA في درجة حرارة الغرفة (RT). لتجنب تلف الأنسجة، لا تستخدم الملقط أبدا لنقل الأدمغة بعد التشريح. قم بتنفيذ جميع الخطوات في أنابيب PCR سعة 200 ميكرولتر على المغذيات.
- لجميع الخطوات ، قبل التخلص من المحلول القديم باستخدام ماصة P200 ، اسمح للأدمغة بالاستقرار في قاع الأنبوب. حاول إزالة المادة الطافية دون شفط الأنسجة. حماية الأنسجة من التعرض للضوء.
- قم بإصلاح الأدمغة في 200 ميكرولتر من 2٪ PFA في وسط زراعة الخلايا S2 لمدة ساعة واحدة أو في 4٪ PFA لمدة 30 دقيقة. حافظ على أوقات التثبيت متطابقة بين العينات من أجل زيادة قابلية التكاثر.
- بعد 3 (أو أكثر) غسلات لمدة 15 دقيقة لكل منها 200 ميكرولتر من محلول غسل دماغ البالغين ، قم بسد الأنسجة ب 200 ميكرولتر من محلول المنع لمدة 30 دقيقة. من الممكن أن تكون أوقات الحضانة الأطول في محلول الحظر.
- احتضان الأدمغة طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول غسل دماغ البالغين بحجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر.< / >
ملاحظه: قد تختلف أوقات الحضانة حسب نوع الجسم المضاد المستخدم. قد تكون الحضانات أطول ضرورية.
- لوضع العلامات على علامات MCFO الثلاثة ، احتضان الأدمغة بأجسام مضادة مضادة ل HA (1: 500) ، ومضادة ل FLAG (DYKDDDDK epitope) (1: 100) ، وأجسام مضادة أولية مضادة ل V5.
- يمكن استخدام الأجسام المضادة الأولية المترافقة مباشرة بدلا من التركيبة الأولية + الثانوية الطبيعية (على سبيل المثال ، مضاد V5: DyLight 549 (1: 200)). في هذه الحالة ، تعامل مع الأجسام المضادة المترافقة مباشرة كأجسام مضادة ثانوية.
ملاحظه: لكل نمط جيني ، احتفظ ببعض الأدمغة كعناصر تحكم للتحقق من خصوصية التلوين. تخطي حضانة الأجسام المضادة الأولية وانتقل مباشرة إلى الخطوة التالية.
- اغسل الأنسجة 3 مرات لمدة ساعة واحدة في 200 ميكرولتر من محلول غسل الدماغ للبالغين (الخطوة 3.3) واحتضانها بمضاعفات الفلوروفور الثانوية / الأجسام المضادة الأولية المترافقة مباشرة المخففة في محلول غسل دماغ البالغين طوال الليل عند 4 درجات مئوية أو لمدة 4 ساعات في RT ، بحجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر
ملاحظه: أمثلة على الأجسام المضادة المناسبة: AlexaFluor 488 (1: 250) ، مضاد V5: DyLight 549 (1: 200) و DyLight 647 (1: 100) - الأجسام المضادة المترافقة.
- اغسل الأدمغة 3 مرات لمدة ساعة واحدة في 200 ميكرولتر من محلول غسيل الدماغ للبالغين ، متبوعا بغسل نهائي في 200 ميكرولتر من PBS طوال الليل عند 4 درجات مئوية أو لمدة 1-2 ساعة في RT ؛ خطوة الغسيل النهائية في PBS تزيل أي آثار ل Triton X-100 وهي ضرورية للحصول على نتائج تلطيخ مثالية. قم بتركيب الأدمغة في وسط تركيب باستخدام عامل مضاد للبهتان على أغطية زجاجية.
< p class = "jove_title" >
6. تركيب الأدمغة للتصوير
- قم بقص فاصل التصوير بالحجم المناسب باستخدام المقص. للفحص المجهري عالي الدقة ، ضع العينة ومباعدة التصوير بين غطاءين زجاجيين.
ملاحظه: فواصل التصوير عبارة عن فواصل لاصقة رفيعة (بسمك 0.12 مم) تقشر وتلتصق بأغطية زجاجية أو شرائح مجهرية ، مما يسمح بتركيب العينات دون ضغط.
- باستخدام الملقط ، قم بإزالة البطانة اللاصقة من سطح واحد وقم بتطبيق الفاصل ، بحيث يكون الجانب اللاصق لأسفل ، على سطح غطاء زجاجي (22 مم × 60 مم). ضع 10 ميكرولتر من وسيط التركيب على غطاء زجاجي جديد.
- باستخدام ماصة P10 ، انقل الأدمغة من أنبوب 200 ميكرولتر إلى الغطاء ، بجوار قطرة وسط التركيب. جنبا إلى جنب مع الأنسجة ، انقل بعض PBS من أجل الحفاظ على الأدمغة في المحلول.
- باستخدام ماصة P10 ، انقل الأدمغة من PBS إلى قطرة وسيط التركيب في محاولة للحد من كمية PBS. انقل العينات في وسط التركيب على الغطاء باستخدام فاصل التصوير. استخدم وسائط تركيب كافية لتغطية العينة.
- قم بإزالة البطانة اللاصقة الأخرى من الجانب العلوي من الفاصل وأضف غطاء زجاجي أعلى العينات. باستخدام طرف الملقط ، ضع ضغطا برفق على المنطقة اللاصقة لإغلاقها. قم بتصوير المناديل المثبتة على الفور أو قم بتخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية لتحليلها لاحقا.
