نقل الميتوكوندريا بمساعدة الطرد المركزي إلى الخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي

الملخص

المصدر: Mombo, B. N., et al. MitoCeption: نقل الميتوكوندريا البشرية المعزولة من MSC إلى الخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي. J. Vis. Exp. (2017)

في هذا الفيديو ، يتم عرض طريقة لتمكين نقل الميتوكوندريا المصنفة بالفلورسنت إلى الخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي (GSCs) من خلال الطرد المركزي. يتم تأكيد الامتصاص الناجح والتكامل الوظيفي للميتوكوندريا المانحة من خلال الكشف عن التألق باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر.

البروتوكول

< ص الفئة = "jove_content" > اليوم 1

< p class = "jove_title" >1. وضع العلامات على الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) الميتوكوندريا

1. قبل يومين من تحضير الميتوكوندريا ، قم بزرع الخلايا الجذعية الجذعية البشرية في طبق عبادة 100 مم ، في 10 مل (الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسي) / FBS (مصل الأبقار الجنينية) 10٪ ، بحيث يكون لديك 4 × 10⁵ MSCs في الثقافة في اليوم الأول.
2. اشطف الخلايا الجذعية الجذعية باستخدام PBS (4 مل) وأضف 4 مل αMEM / FBS 1٪ (دافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية).
3. أضف الكمية المطلوبة من صبغة الميتوكوندريا الحيوية واحتضن الخلايا لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية.
4. قم بإزالة محلول صبغة الميتوكوندريا ، واشطف الخلايا مرتين ب 4 مل مسخن مسبقا (37 درجة مئوية) αMEM / FBS 1٪ وأضف 4 مل αMEM / FBS 10٪. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية.
5. قم بتغيير وسط المزرعة (10 مل αMEM / FBS 10٪) بعد 30 دقيقة ، ومرة أخرى ، بعد ساعتين.

< ص الفئة = "jove_content" > اليوم 1

< p class = "jove_title" >2. وضع العلامات على الخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي (GSC)

1. فصل خط خلايا GSCs Gb4 (10 × 10⁶ خلايا) نمت كمجالات عصبية على قوارير زراعة الخلايا المطلية ب poly-HEMA
بذور
2. GSCs في صفيحة 48 بئرا عند 10⁵ خلايا / بئر في وسط تكاثر GSC (500 ميكرولتر) (انظر الجدول 1).
3. جهاز الطرد المركزي للوحة عند 270 × جم لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية.
4. أضف الكمية المطلوبة من الصبغة الحيوية للخلية واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
5. أضف 500 ميكرولتر من الوسط القاعدي GSC (الجدول 1) لكل بئر من اللوحة المكونة من 48 بئرا.
6. جهاز الطرد المركزي للوحة عند 270 × جم عند 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
7. كرر الخطوات من 2.5 إلى 2.6.
8. أضف 500 ميكرولتر من الوسط القاعدي GSC واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
9. جهاز الطرد المركزي للوحة عند 270 × جم عند 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
10. أضف 500 ميكرولتر من وسط تكاثر GSC لكل بئر من الصفيحة المكونة من 48 بئرا واحتضانها في حاضنة 37 درجة مئوية.
    ملاحظه: تسمح كمية GSCs المشار إليها (10 × 10⁶ خلايا) بإجراء تجارب استجابة الجرعة المختلفة وضوابط FACS. بمجرد تحديد الشروط التجريبية بشكل أكثر دقة ، يمكن تقليص هذا المبلغ.

فئة

3. بذر الخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي

1. اجمع المجالات العصبية GSC (الخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي) (10 × 10⁶ خلايا) عن طريق الطرد المركزي عند 270 × جم لمدة 5 دقائق ، عند 20 درجة مئوية في أنبوب سعة 50 مل.
2. اغسل الخلايا ب 5 مل من HBSS (محلول الملح المتوازن من Hanks) ، وجهاز الطرد المركزي عند 270 × جم لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية.
3. شفط المادة الطافية.
4. أعد تعليق حبيبات GSC برفق في 100 ميكرولتر تريبسين-EDTA (حمض إيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك) (0.25٪) (لكل 10 × 10⁶ خلايا)
5. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
6. أضف 10 ميكرولتر من CaCl₂ (20 مل) و 2 ميكرولتر DNase I (10 مجم / مل).
7. قم بفصل المجالات العصبية عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل (30-50x) باستخدام ماصة P200. تجنب الفقاعات. تحقق تحت المجهر من أن جميع GSCs منفصلة.
8. أضف 10 ميكرولتر مثبط التربسين (5٪) و 10 مل HBSS.
9. أجهزة الطرد المركزي GSCs عند 270 × جم لمدة 7 دقائق عند 20 درجة مئوية.
10. تخلصي من المادة الطافية وأضيفي 10 مل من الوسط القاعدي GSC.
11. عد GSCs بغرفة عد Thoma ثم قم بالطرد المركزي للخلايا عند 270 × جم لمدة 7 دقائق عند 20 درجة مئوية.
12. أضف الحجم المناسب لوسط تكاثر GSC للوصول إلى التركيز الخلوي البالغ 10⁶ GSCs / مل.
13. البذور 10⁵ GSCs (100 ميكرولتر من معلق الخلية) لكل بئر من صفيحة 96 بئر.
قم
14. بالطرد المركزي للألواح عند 270 × جم لمدة 7 دقائق عند 20 درجة مئوية للحصول على GSCs في قاع الآبار.
15. احتضان الصفيحة المكونة من 96 بئرا عند 37 درجة مئوية.

< ص الفئة = "jove_content" > اليوم 2

< p class = "jove_title" >4. MSC (الخلايا الجذعية الوسيطة) عزل الميتوكوندريا

1. اضبط درجة حرارة جهاز الطرد المركزي microtube إلى 4 درجات مئوية.
2. قم بإعداد أنبوبين سعة 1.5 مل "A" و "C" يحتويان على الكواشف لاستخراج الميتوكوندريا (كاشف 200 ميكرولتر A و 400 ميكرولتر كاشف C ، وكلاهما يحتوي على مثبطات البروتياز الخالية من EDTA). قم بإعداد 2 أنابيب أخرى ، تحمل علامة "MSC" و "Mito". احتفظ بجميع الأنابيب على الجليد. قم أيضا بإعداد أنابيب للتخفيفات التسلسلية للميتوكوندريا.
3. اغسل الخلايا الجذعية الجذعية ب 10 مل مسخن مسبقا (37 درجة مئوية) PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات).
4. اغسل الخلايا الجذعية الجذعية ب 2 مل من التربسين (بدون EDTA) لمدة 10 ثوان وأضف 1 مل من التربسين (بدون EDTA). احتضان الخلايا لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
5. استرجع الخلايا الجذعية الجذعية عن طريق إضافة 10 مل αMEM / FBS 10٪ ، ونقلها إلى أنبوب سعة 50 مل.
6. خلايا الطرد المركزي عند 270 × جم لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية.
7. تخلص من المادة الطافية وأضف 10 مل αMEM / FBS 10٪ إلى حبيبات الخلية.
8. عد MSCs بغرفة عد Malassez.
9. أجهزة الطرد المركزي MSCs (4-5 × 10⁵) عند 270 × جم لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية.
10. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 1 متر مثلج αMEM / FBS 10٪ إلى حبيبات الخلية وانقل الخلايا إلى الأنبوب المسمى "MSC". احتفظ بالأنبوب على الجليد.
11. جهاز الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا الجذعية الجذعية عند 900 × جم لمدة 5 دقائق ، عند 4 درجات مئوية.
12. قم بإزالة جميع الوسائط المتبقية من الأنبوب.
13. أضف 200 ميكرولتر من كاشف عزل الميتوكوندريا A (الذي يحتوي على مثبطات البروتياز الخالية من EDTA). دوامة بسرعة متوسطة لمدة 5 ثوان واترك الأنابيب على الجليد لمدة دقيقتين بالضبط.
14. أضف 2.5 ميكرولتر من كاشف عزل الميتوكوندريا B. Vortex بأقصى سرعة لمدة 10 ثوان ، ثم اترك الأنابيب على الجليد. كرر كل 30 ثانية لمدة 5 دقائق.
15. أضف 200 ميكرولتر من كاشف عزل الميتوكوندريا C (الذي يحتوي على مثبطات البروتياز الخالية من EDTA). امزج عن طريق إمالة الأنبوب (حوالي 30 مرة ، لا تدوام). جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 700 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
16. انقل المادة الطافية (التي تحتوي على ميتوكوندريا MSC) إلى أنبوب "ميتو".
17. جهاز طرد مركزي عند 3,000 × جم ، 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، للحصول على حبيبات الميتوكوندريا. تخلص من المادة الطافية. تحتوي الحبيبات على الميتوكوندريا المعزولة.
18. اشطف حبيبات الميتوكوندريا ب 200 ميكرولتر من الكاشف C. ثم ، جهاز الطرد المركزي عند 12,000 × جم ، 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، للحصول على حبيبات الميتوكوندريا.

< p class = "jove_title" >5. نقل الميتوكوندريا MSC المعزولة إلى GSCs (MitoCeption)

1. أضف 200 ميكرولتر من وسط تكاثر GSC المبرد مسبقا (0 درجة مئوية) إلى حبيبات الميتوكوندريا المعزولة من الخلايا الجذعية الجذعية (4 × 10⁵).
2. قم بتخفيف مستحضر الميتوكوندريا (في وسط تكاثر GSC) لإضافة 20 ميكرولتر من معلق الميتوكوندريا باستمرار إلى GSCs.
3. أضف حجم الميتوكوندريا المعزولة إلى آبار الصفيحة المكونة من 96 بئرا التي تحتوي على GSCs ، بالتركيز المطلوب (0.1 إلى 10 ميكروغرام). أضف الميتوكوندريا ببطء ، بالقرب من قاع البئر ، وقم بتغطية السطح بالكامل مرة واحدة على الأقل.
4. جهاز الطرد المركزي ، اللوحة المكونة من 96 بئرا ، والتي تحتوي على GSCs المتلقية للميتوكوندريا مع الميتوكوندريا MSC ولوحة التحكم عند 1,500 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
5. ضع ألواح الثقافة في حاضنة الخلية 37 درجة مئوية مباشرة بعد الطرد المركزي.
   ملاحظه: يعتمد بروتوكول نقل الميتوكوندريا على الطرد المركزي لتعليق الميتوكوندريا على الخلايا المستزرعة بقوة الطرد المركزي الكافية ، مع عدد من أجهزة الطرد المركزي التي يمكن تعديلها اعتمادا على نظام الخلايا المانحة / المتلقية للميتوكوندريا.

< p class = "jove_content" >الجدول 1: وسائل الإعلام الثقافية.

وسط زراعة الخلية تكوين GSC الوسط القاعدي DMEM / F-12 مكمل ب الأنسولين 20 مجم / مل ملحق N2 1x الجلوكوز 3 جم / لتر L-جلوتامين 2 ملي GSC وسيط الانتشار أضف إلى الوسط الأساسي: ملحق B27 1x جنيه 10 نانوغرام / مل bFGF 10 نانوغرام / مل الفطريات 10 مجم / مل Fungizone 0.25 مجم / مل الهيبارين 2 مجم / مل سيبروفلوكساسين 2 ميكروغرام / مل الجنتاميسين 2 ميكروغرام / مل MSC وسيط الانتشار αMEM مكمل ب L-جلوتامين 2 ملي 10٪ FBS bFGF 2 نانوغرام / مل

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: سير عمل لنقل الميتوكوندريا MSC المعزولة إلى GSCs بواسطة MitoCeption. يتم عرض الخطوات السبع ل MitoCeption لميتوكوندريا MSC إلى GSCs وتحليلات GSC اللاحقة. يشار إلى أرقام الخطوات كما في قسم البروتوكول. إذا لم يتم إجراء وضع العلامات على MSC و GSC ، كما هو الحال بالنسبة للتحليلات الوظيفية ، يمكن حذف الخطوتين 1 و 2 ، ويمكن اتباع البروتوكول من اليوم 2 فصاعدا. تمثل صور تباين الطور Gb4 GSC...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
طقم عزل الميتوكوندريا للأنسجة	فيشر العلمي	10579663
ملحق N-2 (100X)	فيشر العلمي	11520536
ملحق B-27 بدون فيتامين أ (50X)	فيشر العلمي	11500446
HBSS w / o Ca2 + w / o Mg2 +	سيجما	H4385
بولي هيم	سيجما	P3932
aMEM w / o glutamine	أوزيم	BE12-169F
DMEM/F-12 بدون الجلوتامين،	فيشر العلمي	11540566
L-جلوتامين	Invitrogen	25030-024
الجلوكوز	سيجما	G7021
إنسولين	سيجما	أنا 1882
bFGF البشري	أنظمة البحث والتطوير	233-FB-025
EGF البشري	Peprotech	AF-100-15
الهيبارين	سيجما	H3149
CaCl2	ميرك	2382
مثبط التربسين	سيجما	T9003
DNase I	SIGMA	10104159001
التربسين 0.25٪ / EDTA 1 ملي مولار	Invitrogen	25200056
التربسين	جيبكو	15090-046
مثبطات البروتياز EDTA مجانا	سيجما	4693159001
سيبروفلوكساسين	سيجما	17850-5G-F
الفطريات	إنفيوجين	ant-fn-1
Fungizone	الرصيد الحراري	15290018
جنتاميسين	يوروميدكس	EU0410
MitoTracker Green FM	المجسات الجزيئية	M7514
MitoTracker Red CMXRos	المجسات الجزيئية	M7512
MitoTracker ديب ريد FM	المجسات الجزيئية	M22426
CellTracker أخضر CMFDA	المجسات الجزيئية	C7025
CellTracker أزرق CMF2HC	المجسات الجزيئية	C12881
ريبا	سانتا كروز	SC-24948
طبق ثقافة FluoroDish المعقم	أجهزة الدقة العالمية	FD35-100
مقياس الدم	فيشر العلمي	267110
أنابيب FACS	بيكمان كولتر	25,23,749
جهاز FACS	غاليوس	3L 10C
LC FAST START DNA MASTER PLUS	روش	3515885001