تلطيخ مضان لخلايا القمة العصبية المزروعة على الهلاميات المائية ذات الصلابة المتفاوتة

الملخص

المصدر: Le، T. P.، et al.، نظام O9-1 / هيدروجيل محسن لدراسة الإشارات الميكانيكية في خلايا القمة العصبية. J. V is. خبرة (2021)

في هذا الفيديو ، نصف إجراء إجراء تلطيخ التألق باستخدام الفحص المجهري الفلوري لإثبات تلطيخ الفالويد لخلايا القمة العصبية المزروعة على الهلاميات المائية ذات الصلابة المتفاوتة لتصور وتحليل تنظيم الهيكل الخلوي.

البروتوكول

فئة

1. التحليل الجزيئي للتصلب عن طريق تلطيخ التألق المناعي

1. استخدم الملقط لنقل الغطاء إلى لوحة جديدة لتقليل الإشارات الخاطئة من الخلايا المزروعة مباشرة على اللوحة. اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من PBS المعقم ثلاث مرات لإزالة الخلايا الميتة وأي وسط استزراع متبقي.
2. قم بإصلاح الخلايا باستخدام 500 ميكرولتر غير مضطرب من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أعد غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS / جيدا لمدة دقيقتين لكل منهما.
   ملاحظة: يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية للتوقف الإجرائي
3. عالج الخلايا ب 500 ميكرولتر من 0.1٪ Triton X-100 لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS / جيدا.
4. سد الخلايا ب 250 ميكرولتر من مصل الحمير 10٪ (مخفف في PBS و 0.1٪ Tween 20) لكل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
5. احتضان الخلايا بالفالودين المستخدم في تلطيخ F-actin عند تخفيف 1: 400 في 250 ميكرولتر من مصل الحمار 10٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منها.
   ملاحظة: يمكن احتضان 568 نانومتر الفالودين مع الأجسام المضادة الثانوية 488 نانومتر أو 647 نانومتر أو بمفرده.
6. احتضان الخلايا باستخدام 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ، تخفيف 1: 1000) في 250 ميكرولتر من PBS لمدة 10 دقائق متبوعا بغسل أخير من PBS لمدة دقيقتين.
7. أضف 3-4 قطرات من وسط التركيب إلى كل بئر. قم بتخزين العينات عند 4 درجات مئوية لضبطها لمدة ساعتين على الأقل قبل التصوير للتأكد من ضبط وسط التركيب بشكل صحيح.
8. باستخدام المجهر الفلوري ، التقط صورا لما لا يقل عن 3 إطارات عشوائية لكل عينة هيدروجيل ، مما ينتج عنه قنوات فردية ومدمجة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
2 مم # 1 غطاء زجاجي كورنينج 0211	كيمجلاس لعلوم الحياة	CLS-1763-012
25 مم # 1 كورنينج 0211 غطاء زجاجي	كيمجلاس لعلوم الحياة	CLS-1763-025
لوحة زراعة الخلايا ذات 4 آبار	حراري علمي	179830
4٪ بارافورمالدهايد	سيجما ألدريتش	J61899-AP
40٪ أكريلاميد	سيجما ألدريتش	A4058
أليكسا فلور 488 فالويدين	ثيرمو فيشر	A12379
الكولاجين من النوع الأول (100 مجم)	كورنينج	354236
DAPI (4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole، ثنائي هيدروكلوريد)	ثيرمو فيشر	D1306
مصل الحمار	سيجما ألدريتش	D9663
معقم 1x PBS	Hyclone	SH30256.02
المجهر الفلوري	لايكا