$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.
1. إعداد حلول العمل والمخازن المؤقتة
ملاحظة: في صباح يوم الفحص ، قم بإعداد الحلول التالية. يعتمد هذا الحساب على الحلول اللازمة لمعالجة منطقتين من الدماغ (أي قشرة الفص الجبهي [PFC] والحصين [HPC]) من 12 فأرا.
- تحضير السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF ، الرقم الهيدروجيني = 7.4) كما هو مذكور في الجدول 1 . قم بتوزيع 750 ميكرولتر من aCSF في كل أنبوب أخذ العينات ، وضعها في كتلة درجة الحرارة المعدنية على الجليد لتبريد المخزن المؤقت مسبقا.
- قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل كما هو مذكور في الجدول 2 . يحفظ على الثلج (400 ميكرولتر لاستخدامها لكل عينة).
- قم بإعداد محلول مخزون Bis (sulfosuccinimidyl) أو BS3 سعة 52 ملي مولار (26x) في محلول 5 ملي مولار من سترات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني = 5.0).
- أولا ، قم بإعداد 100 ملي مولار من حامض الستريك (المخزون أ) و 100 ملي متر سترات الصوديوم (المخزون ب).
- خفف المخزون A والمخزون B بنسبة 1:20 بالماء منزوع الأيونات. أضف 100 ميكرولتر لكل إلى 1.9 مل من الماء لتحضير 5 ملي مولار من حامض الستريك (مخزون C) و 5 ملي مولار من سترات الصوديوم (المخزون D) ، على التوالي.
- امزج 410 ميكرولتر من المخزون C و 590 ميكرولتر من المخزون D لتحضير مخزن مؤقت لسترات الصوديوم 5 ملي مولار (الرقم الهيدروجيني = 5.0) (المحلول E ، 1 مل).
- تأكد من الرقم الهيدروجيني للمحلول E باستخدام شريط مؤشر الأس الهيدروجيني.
- قم بإذابة 24 مجم من BS3 في 806.4 ميكرولتر من المحلول E عن طريق الدوامة لمدة 30 ثانية لتحضير محلول مخزون BS3 (26x).
- قم بإعداد 1 مل أخرى من المحلول E لاستخدامه كتحكم في السيارة للعينات غير المتشابكة.
ملاحظة: قم بإعداد محلول مخزون BS3 عندما يكون كل شيء آخر جاهزا ، وتكون التجربة على وشك البدء. يجب تخزين BS3 مجففا عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. بمجرد إعادة تشكيله ، يظل BS3 نشطا لمدة ≤3 ساعات تقريبا. نظرا لأن الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت لسترات الصوديوم 5 ملي مولار (المحلول E) يرتفع بمرور الوقت ، مما يتسبب في التحلل المائي المتسارع BS3 ، فمن المستحسن تحضير المحلول E طازجا من محاليل المخزون A و B. نظرا للذوبان المحدود ل BS3 في درجات حرارة منخفضة ، يجب الاحتفاظ ب BS3 المعاد تكوينه عند RT. استخدم BS3 المعاد تكوينه في غضون 3 ساعات ، ولا تقم بتجميد / إذابة الجليد أو إعادة استخدام BS3 المعاد تكوينه.
2. تشريح أنسجة المخ
ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، يجب أن يعمل شخصان على الأقل معا بطريقة منسقة. بينما يركز شخص ما على تشريح ، يجب أن يعمل الشخص الآخر كضابط وقت ويساعد في تنسيق الفحص.
- أحضر الأول للتشريح من منطقة السكن إلى غرفة التشريح.
ملاحظة: نظرا لأن الضغوطات الحادة (على سبيل المثال ، بيئة جديدة ، رائحة الدم) قد تؤثر على ديناميكيات بروتين الدماغ ، يجب إبقاء في أقفاص منزلها الموضوعة بعيدا عن منطقة التشريح ثم إحضارها بشكل فردي إلى غرفة التشريح لقطع الرأس على الفور.
- قتل الفأر عن طريق خلع عنق الرحم متبوعا بقطع الرأس. قم بإزالة الدماغ بسرعة من الجمجمة واغمرها في PBS مثلج في طبق بتري لمدة 10-15 ثانية ( الشكل 1 ).
ملاحظة: لا يتم تخدير لتجارب BS3 لأن أي عامل تخدير يمكن أن يؤثر على مستوى العرض السطحي لمستقبلات الناقل العصبي.
- ضع الدماغ المبرد في مصفوفة الدماغ على الجليد ، بحيث يكون الجانب البطني من الدماغ متجها لأعلى ( الشكل 2 ).
- أدخل شفرة الحلاقة الأولى عبر الحدود بين البصلة الشمية والساق الشمية لقطع الدماغ إكليليا ( الشكل 3 ). باستخدام ثلاث إلى أربع شفرات حلاقة إضافية ، قم بقطع الجزء الأمامي من الدماغ بشكل متسلسل بفواصل 1 مم.
- ارفع الشرائح الإكليلية من مصفوفة الدماغ عن طريق تثبيت جميع شفرات الحلاقة التي تم إدخالها معا ، تاركا الجزء الخلفي من الدماغ خلفه في مصفوفة الدماغ. استخدم ملقط لفصل شفرات الحلاقة عن بعضها البعض ، وضعها على سطح مستو مبرد بحيث تكون شريحة الدماغ متجهة لأعلى ( الشكل 4 ).
- حدد الشرائح التي تحتوي على منطقة الاهتمام. لأخذ عينات من PFC ، اختر الشريحتين الثانية والثالثة خلف الشريحة الأولى التي تحتوي على السويقة الشمية.
- قم بإزالة المنطقة ذات الاهتمام باستخدام لكمة الأنسجة ، وضعها جانبا على شفرة الحلاقة المبردة ، وقسم الأنسجة بالتساوي إلى قسمين (على سبيل المثال ، الأنسجة من نصف الكرة الأيسر مقابل نصف الكرة الأيمن ، مع استخدام النصف الآخر لتفاعل التشابك BS3 والنصف الآخر للتحكم في عدم التشابك إذا تم التعبير عن البروتين المستهدف محل الاهتمام بالتساوي في نصفي الكرة الأرضية).
- افرم كل منديل إلى قطع على شفرة الحلاقة باستخدام الطرف الدقيق من الملقط بحركات رأسية متعددة ضد الشفرة بدلا من هرس الأنسجة أو طحنها. سيؤدي ذلك إلى زيادة مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها بواسطة BS3 دون المساس بشدة بسلامة غشاء الخلايا. مباشرة بعد الفرم ، انقل الأنسجة المفرومة إلى الأنابيب المناسبة (انظر الخطوة 3.3).
3. تفاعل التشابك
- أحضر التالي للتشريح من منطقة السكن إلى غرفة التشريح عندما يكون تشريح دماغ الفأر السابق على وشك الانتهاء (الخطوة 2.10).
- قم برفع الأنبوب المبرد مسبقا على الجليد باستخدام 30 ميكرولتر من محلول BS3 (26x) أو محلول السيارة E قبل أن تصبح الأنسجة المفرومة جاهزة للنقل إلى الأنابيب المناسبة. قم بتغيير أطراف الماصة بين الأنابيب للتأكد من عدم تلوث BS3 في أنابيب التحكم غير المتشابكة.
- انقل الأنسجة المفرومة (من الخطوة 2.8) إلى الأنابيب المناسبة ، ثم ابدأ في تشريح التالي (الخطوة 2.2).
- اقلب الأنبوب واخلطه لتقسيم قطع الأنسجة إلى قطع أصغر ، وابدأ في احتضان العينات على دوار الأنبوب في الغرفة الباردة لمدة 30 دقيقة إلى ساعتين. سجل وقت بدء حضانة BS3 لكل أنبوب. راجع قسم المناقشة لمعرفة وقت الحضانة الأمثل.
- قم بإخماد التفاعل عن طريق تحريك الأنبوب ب 78 ميكرولتر من 1 م جلايسين واحتضان العينة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية مع دوران مستمر. سجل وقت بدء وانتهاء التبريد لكل أنبوب. استمر في مساعدة الشخص الذي يركز على تشريح عن طريق إحضار التالي (الخطوة 3.1) والمساعدة في التشابك (الخطوة 3.2).
ملاحظة: عالج كل عينة في نفس الوقت بالضبط عبر جميع العينات. إذا كانت غرفة التشريح بعيدة عن الغرفة الباردة ، فمن المستحسن بشدة تجنيد شخص ثالث للمشاركة في حضانة العينة والتبريد في الغرفة الباردة.
الجدول 1: تكوين السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي.
| conc. | حل الأسهم | كمية محلول المخزون المراد الاستغناء عنه |
| 1.2 ملي مولار CaCl2 | 480 ملم (400x)* | 100 ميكرولتر |
| 20 ملم هيبس | 1 م (50x) | 800 ميكرولتر |
| 147 ملي كلوريد الصوديوم | 5 م (34x) | 1176.5 μL |
| 2.7 ملي مولار KCl | 1.08 م (400x) | 100 ميكرولتر |
| 1 mM MgCl2 | 400 ملم (400x) | 100 ميكرولتر |
| 10 ملي مولار جلوكوز | 2.5 م (250x) | 160 ميكرولتر |
| الماء منزوع الأيونات | | 37.563 مل |
| الإجمالي | | 40 مل |
| * يجب تحضير مخزون CaCl2 طازجا في يوم التجربة. |
الجدول 2: تكوين المخزن المؤقت للتحلل
| conc. | حل الأسهم | مقدار محلول المخزون المراد الاستغناء عنه |
| 25 ملم هيبس | 1 م (40x) | 500 ميكرولتر |
| 500 ملي كلوريد الصوديوم | 5 م (10x) | 2 ملل |
| 2 ملم EDTA | 0.5 م (250x) | 80 μL |
| 1 ملم DTT | 1 م (1000x) | 20 ميكرولتر |
| 0.1٪ NP-40 | 10٪ (100x) | 200 ميكرولتر |
| كوكتيل مثبط للبروتين | 100 × | 200 ميكرولتر |
| ماء منزوع الأيونات | | 17 مل |
| الإجمالي | | 20 مل |
