تقييم امتصاص الجلوكوز في الخلايا العصبية الحركية ليرقات ذبابة الفاكهة مع استقلاب الجلوكوز المنظم

الملخص

المصدر: Loganathan، S.، et al.، قياس امتصاص الجلوكوز في ذبابة الفاكهة نماذج اعتلال البروتين TDP-43. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح الفيديو تقنية لقياس امتصاص الجلوكوز في ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية الحركية اليرقية باستخدام مستشعر الجلوكوز داخل الخلايا القائم على نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET). بعد تشريح اليرقات لفضح الحبل العصبي البطني ، يتم تصور الخلايا العصبية الحركية من خلال التألق المنبعث من الفلوروفور المتبرع بالمستشعر. عند تحفيزه بالجلوكوز ، يؤدي FRET بين الفلوروفورات المانحة والمستقبلة للمستشعر إلى انبعاث التألق من المستقبل ، مما يتيح مقارنة امتصاص الجلوكوز بين يرقات التحكم واليرقات الطافرة مع استقلاب الجلوكوز المنظم.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. ذبابة الفاكهة تسلخ الحبل العصبي البطني (VNC)

1. اصنع أطباق تشريح المطاط الصناعي السيليكوني.
   1. صب مكونات المطاط الصناعي السيليكون في أنبوب سعة 50 مل كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة وحركها جيدا.
   2. املأ أطباق زراعة الأنسجة مقاس 35 مم بحوالي 2 مل من خليط المطاط الصناعي. استخدم حقنة لإزالة أي فقاعات. غطي الأطباق وضعيها على سطح مستو في فرن 60 درجة مئوية طوال الليل للعلاج.
2. تشريح ذبابة الفاكهة يرقات لفضح VNC مع الحفاظ على صلاحية الأنسجة.
   1. اجمع يرقة الطور الثالث المتجولة ، واشطفها ب ddH₂O ، ثم ضعها في قطرة من المخزن المؤقت الشبيه بالهيموليمف 3 (HL3) (70 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي كلوريد_{الصوديوم 2} ، 10 ملي مولار NaHCO₃ ، 115 ملي مولار سكروز ، 5 ملي تريهالوز ، 5 ملي هيدروكسي إيثيل بيبرازين إيثان حمض السلفونيك [HEPES] ؛ درجة الحموضة 7.1) على طبق مبطن بالمطاط الصناعي.
   2. باستخدام زوج من الملقط (# 5 أو 55 ملقط) تحت مجهر تشريح ، قم بتثبيت الأطراف الأمامية والخلفية لليرقة على الجانب الظهري لأعلى ، مع تمديد اليرقة بعناية بالطول باستخدام دبابيس الحشرات (دبابيس مينتين).
   3. قم بعمل شق فوق الدبوس الخلفي مباشرة باستخدام مقص قزحية بزاوية. قم بعمل قطع عمودي بدءا من الشق باتجاه الطرف الأمامي لليرقة.
   4. أضف بضع قطرات من المخزن المؤقت HL-3 إذا لزم الأمر. إزالة القصبة الهوائية وبقية الأعضاء العائمة دون إزعاج الجهاز العصبي المركزي (CNS). قم بتثبيت اللوحات التي تمد جدار الجسم لفضح الجهاز العصبي المركزي مع الحفاظ على الجهاز العصبي العضلي (VNCs والمحاور والوصلات العصبية العضلية) سليمة.

2. الحصول على الصور

1. تحسين معلمات التصوير.
   1. قم بتشغيل المجهر والليزر قبل بدء التشريح. يجب الحصول على الصور باستخدام مجهر متحد البؤر عمودي مع عدسة غمر في الماء 40x. استخدم ليزر 405 نانومتر لإثارة البروتين الفلوري السماوي (CFP) والحصول على الصور في كل من قنوات الكشف CFP (465-499 نانومتر) و FRET (535-695 نانومتر).
   2. قم بتحسين معلمات الاكتساب مثل سرعة المسح الضوئي (6) والمتوسط (2) والهدف (40x) والتكبير/التصغير (1x) وحجم الثقب (1 وحدة فلكية) والدقة المكانية (512 × 512). اضبط الكسب بحيث تكون الإشارة في النطاق الديناميكي الأمثل. يجب استخدام نفس المعلمات لجميع الأنماط الجينية.
2. صورة الخلايا العصبية الحركية داخل VNC.
   1. ضع طبق السيليكون مع العينة المقطعة تحت العدسة. اخفض العدسة بحيث تتلامس مع المخزن المؤقت تريهالوز والسكروز HL3. من الأهمية بمكان التأكد من أن العدسة مغمورة بالكامل في المخزن المؤقت. أضف المزيد من المخزن المؤقت إذا لزم الأمر.
   2. استخدم قنوات CFP و FRET لتحديد قسم بصري يتكون من 6 خلايا عصبية حركية على الأقل في التركيز ، تقع على طول خط الوسط VNC. يتم تحديد الخلايا العصبية الحركية بناء على التعبير عن مستشعر الجلوكوز وموقعها على طول المحور الأمامي الخلفي.
   3. احصل على صور كل 10 ثوان لمدة 10 دقائق. تمثل هذه الصور خط الأساس.
3. تحفيز مع الجلوكوز المكمل HL-3.
   1. قم بإزالة التريهالوز والسكروز المحتوي على محلول HL3 باستخدام ماصة باستور واستبدلها ب 5 ملي مولار من الجلوكوز المكمل HL-3 (70 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي كلوريد كلوريد ، 20 ملي كلوريد_{المجم 2} ، 10 ملي مولار هيدروكلوريد_{الصوديوم 3} ، 115 ملي سكروز ، 5 ملي مولار جلوكوز ، 5 ملي مولار هيبيس ، درجة الحموضة 7.1). يجب تنفيذ هذه الخطوة بعناية فائقة ، لتجنب حركة VNC قدر الإمكان.
   2. احصل على الصور كل 10 ثوان لمدة 10 دقائق أخرى. تمثل هذه الصور مرحلة التحفيز.
4. احفظ الصور كملفات .czi أو أي نوع ملف يدعمه برنامج التصوير باسم ملف بما في ذلك التاريخ والخلفية الجينية والحالة التجريبية (خط الأساس أو التحفيز) والقنوات المستخدمة.
5. أعد استخدام المعلمات لتصوير جميع الأنماط الجينية (الشكل 1 أ).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تحليل الصور لمستشعر الجلوكوز في سياق طفرة TDP-43. (أ) صور تمثيلية لإشارات FRET و CFP في عناصر التحكم في مستشعر الجلوكوز وعينات TDP-43^G298S في ظل ظروف خط الأساس والتحفيز. يتم تحديد الخلايا العصبية الحركية التمثيلية في كل صورة كمثال على عائد الاستثمار. أشرطة المقياس: 20 ميكرومتر التكبير: 40x. (ب) متوسط نسب FRET / CFP في مستشعر الجلوكوز وا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أطباق زراعة الأنسجة مقاس 35 مم	سيجما ألدريتش	CLS430165
عدسة غمر الماء 40X	زايس	440090	قابل للطيب, N.A. 0.8
مقص تشريح	روبوز	RS-5618
دومون # 5 ملقط	VWR	100189-236
دومون # 55 ملقط	VWR	100189-244
دبابيس Minutien	أدوات العلوم الجميلة	26002-10	تستخدم للتشريح
SYLGARD 184 مجموعة المطاط الصناعي السيليكون	داو	1317318
Zeiss LSM880 NLO مجهر متعدد الفوتون / متحد البؤر المستقيم	زايس	غير متاح