$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.
< ص الفئة = "jove_title" >
1. تلطيخ المناعة
ملاحظة: قم بإجراء جميع عمليات الغسيل والحضانات على شاكر منصة مدارية مضبوطة على 100 دورة في الدقيقة تقريبا. يتم تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ، باستثناء حضانة الجسم المضاد الأساسي ، والتي يتم إجراؤها عند 4 درجات مئوية. قم بإعداد وسائط التثبيت في وقت مبكر عن طريق دمج المكونات في أنبوب سعة 50 مل وخلطها على المغذيات طوال الليل. يحفظ من الضوء ويخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهرين. إذا كانت إشارة الفلورسنت الداخلية كافية للتصوير والتحليل دون الحاجة إلى تلطيخ مناعي ، فيمكن تخطي الخطوات 1.1-1.9. في حالة تخطي التلوين المناعي ، قم بإجراء ثلاث غسلات لمدة 10 دقائق في TBS وانتقل إلى الخطوة 1.10.
- قم بإعداد محلول جديد من TBST (0.2٪ Triton في TBS) عن طريق إضافة 1 مل من 10٪ Triton-X إلى أنبوب 50 مل وملء الأنبوب إلى 50 مل ب 1x TBS. قم بإعداد 2 مل من محاليل الحجب والأجسام المضادة (10٪ مصل الماعز في TBST) لكل دماغ.
ملاحظه: للحصول على أفضل النتائج ، قم بعمل TBST جديد لكل تجربة تلطيخ جديدة واستخدم مصدرا عالي الجودة من 10٪ Triton-X المائي (جدول المواد).
- قم بتسمية صفيحة 24 بئرا وفقا للتخطيطي (الشكل 1). ضع عينات مختلفة في صفوف مختلفة وحلول مختلفة في أعمدة مختلفة. أضف 1 مل من TBST إلى الأعمدة الثلاثة الأولى ("Wash 1" و "Wash 2" و "Wash 3"). أضف 1 مل من محلول الحظر إلى العمود الرابع.
- قم بإعداد معول زجاجي عن طريق إذابة نهاية ماصة باستور 5.75 في خطاف صغير باستخدام موقد بنسن. استخدم هذا الاختيار لنقل أقسام الأنسجة من اللوحة المكونة من 12 بئرا إلى عمود الغسيل 1 في اللوحة المكونة من 24 بئرا.
ملاحظه: للحصول على أفضل النتائج ، قم بفحص الأقسام قبل البدء في التلوين. لفحص الأقسام ، انقل الأقسام واحدة تلو الأخرى إلى طبق بتري مملوء ب 1x TBS وافحص الأقسام باستخدام مجهر فلوري بهدف 5x أو 10x لضمان وجود عدد كاف من الخلايا المصنفة بالفلورسنت. يوصى بتلوين أربعة إلى ستة أقسام لكل بئر ، على الرغم من أنه قد يتم تلطيخ ما يصل إلى ثمانية أقسام لكل بئر إذا لزم الأمر.
- اغسل الأقسام لمدة 10 دقائق في كل من الآبار 1 و 2 و 3 ، متبوعة باحتضانها لمدة ساعة واحدة في محلول الحبس. استخدم معول الزجاج لنقل الأقسام من بئر إلى آخر. يمكن استخدام الانتقاء لنقل أقسام متعددة من الدماغ في وقت واحد.
- قم بإعداد 1 مل من محلول الأجسام المضادة الأولية لكل عينة (على سبيل المثال ، Rabbit RFP 1: 2000 أو Chicken GFP 1: 2000). أضف الجسم المضاد إلى محلول الجسم المضاد ، والدوامة لفترة وجيزة ، ثم جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند ≥ 4,000 × جم عند 4 درجات مئوية. احتضن الأقسام في الجسم المضاد الأولي لمدة ليلتين إلى ثلاث ليال عند 4 درجات مئوية أثناء الرج.
- بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية ، قم بشفط اليوم 1 TBST من آبار الغسيل ، وأضف 1 مل من TBST الجديد إلى كل بئر غسيل ، وانقل الأقسام إلى بئر الغسيل الأول. اغسل الأقسام 3 مرات لمدة 10 دقائق لكل منها.
ملاحظه: للشفط ، استخدم ماصة باستور مقاس 9 بوصات متصلة بأنبوب بقارورة مفرغة من الهواء. يمكن استخدام خطوط التفريغ المنزلية أو مضخة التفريغ الكهربائية كمصدر فراغ.
- أثناء غسل الأقسام ، قم بإعداد محاليل الأجسام المضادة الثانوية بتركيز 1: 200 عن طريق إضافة أجسام مضادة إلى محلول الجسم المضاد (على سبيل المثال ، مضاد للأرانب 594 أو مضاد الدجاج 488). دوامة لفترة وجيزة ، ثم تدور لمدة 5 دقائق عند ≥ 4,000 × جم عند 4 درجات مئوية.
- احتضان الأقسام في الجسم المضاد الثانوي لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة. حماية الأقسام من الضوء خلال هذه الخطوة وجميع الخطوات التالية للتخفيف من تبييض الأجسام المضادة الثانوية.
- بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية ، استنشق اليوم 2 TBST من آبار الغسيل ، وأضف 1 مل من TBST الجديد إلى كل بئر غسيل ، وانقل الأقسام إلى بئر الغسيل الأول. اغسل الأقسام 3 مرات في TBST لمدة 10 دقائق لكل منها.
- أثناء الغسيل النهائي ، أخرج وسائط التثبيت من 4 درجات مئوية واتركها تسخن إلى درجة حرارة الغرفة. حضري خليطا 2: 1 من 1x TBS: ماء مقطر وأضفه إلى طبق بتري. قم بإعداد شريحة مجهرية عن طريق إضافة 800 ميكرولتر من 2: 1 TBS: dH2O إلى السطح.
ملاحظه: يوصى بشدة باستخدام وسائط التثبيت غير المعالجة. يمكن أن تؤدي وسائط التثبيت المتصلبة إلى تغيير حجم الأنسجة مما قد يربك تحليل حجم منطقة الخلايا النجمية. يتم توفير وصفة لوسائط تركيب بسيطة وغير مكلفة محلية الصنع في جدول المواد.
- باستخدام فرشاة رسم دقيقة ، انقل الأقسام واحدة تلو الأخرى من Wash 3 جيدا إلى طبق بتري. تزيل هذه الخطوة التريتون وتساعد الأقسام على التسطيح. بعد ذلك ، انقل الأقسام من طبق بتري إلى السائل الموجود على الشريحة.
- استخدم فرشاة رسم للمساعدة في ترتيب الأقسام بحيث تكون مسطحة على الشريحة. قم بإزالة السائل الزائد بعناية من الشريحة باستخدام ماصة P1000 ، متبوعا بشفط الفراغ.
ملاحظه: أضف طرف ماصة P200 إلى نهاية ماصة باستور للتحكم الدقيق في الشفط بالتفريغ.
- بمجرد إزالة كل السائل الزائد من الشريحة، استخدم ماصة نقل لإضافة قطرة واحدة من وسائط التثبيت على الفور إلى كل قسم ووضع غطاء برفق فوق الشريحة. اسمح لوسائط التركيب بالانتشار لبضع دقائق ، ثم قم بإزالة أي وسائط تثبيت زائدة تخرج من أسفل الغطاء عن طريق الشفط بالفراغ.
ملاحظه: لا تدع الأقسام تجف في أي وقت قبل إضافة وسائط التثبيت. إذا بدأت الأقسام في الجفاف قبل إضافة وسائط التركيب ، فقد يؤثر ذلك على حجم الأنسجة ويعيق جمع البيانات بدقة.
- أغلق جميع الحواف الأربعة للغطاء بطلاء أظافر شفاف. اترك الشرائح تجف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بتخزينها بشكل مسطح عند 4 درجات مئوية. انتظر لمدة ساعتين على الأقل قبل التصوير ، أو صور في اليوم التالي.
ملاحظة: يمكن تخزين الأقسام الملطخة بالأجسام المضادة ضد GFP (بروتين الفلورسنت الأخضر) و RFP (بروتين الفلورسنت الأحمر) لمدة تصل إلى أسبوعين قبل التصوير ، بشرط أن تكون مختومة تماما بطلاء الأظافر.
