$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.
< p class = "jove_title" >
1. تقسيم الأنسجة
- قطع قطعة صغيرة من الأنسجة (~ 1 سم × 1 سم) للتقسيم. أعد الأنسجة المتبقية إلى الثلج الجاف / -80 درجة مئوية في الفريزر
ملاحظه: تأكد من أن قسم الأنسجة هو ~ 95٪ قشرة المخيخ ، حيث توجد خلايا بركنجي.
- ضع كومة بارتفاع 3 مم تقريبا من OCT لتغطية "تشاك". ابدأ ببناء الطبقات في الأعلى بحركة دائرية بطيئة حتى يكون هناك كومة صغيرة.
- بمجرد تجميد OCT جزئيا ولكن لا يزال يحتوي على بعض السوائل في المنتصف ، ضع الأنسجة فوقه. لا تدفع الأنسجة بعمق في OCT. اترك الأنسجة فوقها حتى تتجمد تماما ، الأمر الذي سيستغرق 1-2 دقيقة.
- ضع "تشاك" مع OCT المجمد والأنسجة في ذراع قطع ناظم البرد. اضبط المنديل بحيث يتدفق بشفرة القطع.
- اسمح للأنسجة بالجلوس في ذراع القطع لمدة 15-20 دقيقة للتكيف مع درجة الحرارة الجديدة.
ملاحظه: اعتمادا على سمك الأنسجة ، هناك حاجة إلى وقت للتأقلم مع درجة الحرارة. اترك الأنسجة تجلس طالما كان ذلك مطلوبا للقطع بشكل نظيف. اضبط OT و CT للمساعدة في التأقلم مع درجة حرارة الأنسجة.
- حرك الأنسجة ببطء بالقرب من الشفرة. بمجرد وصول الأنسجة إلى الشفرة ، ابدأ عملية التشذيب. يجب ضبط سمك القطع على 30 ميكرومتر.
- تقليم 2-3x حتى تظهر طبقات القشرة.
- ضع اللوحة المضادة للدحرجة وقم بمحاذاة الجزء العلوي من شفرة ناظم البرد.
ملاحظه: سيظهر خط فضي من الضوء الموجود في ناظم البرد عند واجهة الشفرة واللوحة المضادة للانزلاق. يشير هذا إلى أن اللوحة المضادة للانزلاق تقع مباشرة على حافة الشفرة.
- ابدأ في قطع الأقسام عند 14 ميكرومتر. ستكون الأقسام المقطوعة بشكل صحيح مسطحة تحت اللوحة المضادة للدحرجة.
ملاحظه: إذا كان النسيج عالقا ، فتأكد من أن اللوحة المضادة للدحرجة باردة بدرجة كافية. إذا لزم الأمر ، فإن وضع قطعة من الثلج الجاف من الخارج (الجانب الذي لا يلمس المسرح) سيؤدي إلى تبريد اللوحة المضادة للدحرجة بسرعة.
- قم بقص 4-6 أقسام وقم بمحاذاة أفقيا عبر مرحلة ناظم البرد.
- بزاوية الشريحة ، التقط كل قطع الأنسجة في وقت واحد.
ملاحظه: باستخدام الفرش ، ارفع أطراف الأنسجة لجعلها متاحة بسهولة أكبر للشريحة عند التقاطها. لا تلتقط قسما واحدا في كل مرة. سيؤدي التعرض للهواء في درجة حرارة الغرفة إلى تدهور سلامة الحمض النووي الريبي.
أنذر: لا تدع الغشاء يلمس مرحلة ناظم التبريد. إذا لامس الغشاء المسرح ، فسيبدأ في الانفصال عن الشريحة الزجاجية وسيتسبب في حدوث أخطاء عند محاولة المضاعف المشترك الأصغر للتعليم.
- انتقل على الفور إلى الخطوة 6. لا تؤخر التثبيت.
< p class = "jove_title" >
2. إصلاح الأنسجة / التصور الخالي من البقع
- انتقل على الفور إلى بروتوكول تثبيت الإيثانول
- ضع الشريحة في حامل الشريحة مع 70٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين - على الثلج.
- ضع الشريحة في حامل الشريحة مع 95٪ من الإيثانول لمدة 45 ثانية - على الثلج.
- ضع الشريحة في حامل الشريحة مع 100٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين - في RT.
- اغمس الشريحة 3 مرات في حامل الشريحة باستخدام الزيلين 1 - في RT.
- ضع الشريحة في حامل الشريحة مع الزيلين 2 لمدة 5 دقائق - في RT.
- اتركيه ليجف في مكان نظيف لمدة 30 دقيقة على الأقل. أوقات الجفاف الأطول ، التي تصل إلى 60 دقيقة ، هي الأمثل.
أنذر: استخدم شرائح الوقوف للتجفيف في غطاء الدخان. الزيلين متقلب. سيؤدي وضع الشرائح بشكل مسطح إلى تجمع الزيلين في قسم الأنسجة ، مما يجعل الأنسجة داكنة للغاية.
3. إذابة الشرائح المخزنة للاستخدام
- قم بإزالة الأنبوب بشريحة واحدة من الفريزر -80 درجة مئوية قبل ساعة واحدة من الاستخدام المقصود.
- لا تفتح الأنبوب على الفور. اسمح للأنبوب بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة. سيحدث التكثيف على السطح الخارجي للأنبوب فقط.
- بمجرد وصول الأنبوب إلى درجة حرارة الغرفة واختفاء كل التكثيف (حوالي 30-40 دقيقة) ، قم بإزالة الغطاء وعرض الشريحة للهواء في درجة حرارة الغرفة.
- اسمح للشريحة بالتأقلم مع درجة حرارة الغرفة لمدة 15-20 دقيقة. ثم اتركه داخل الأنبوب مع إزالة الغطاء.
ملاحظه: الشريحة جاهزة الآن للرشاشة المضاعفة المشتركة.
فئة
4. التشريح الدقيق لخلايا بركنجي بالليزر
ملاحظة: سيناقش قسم البروتوكول هذا فقط التفاصيل المتعلقة بالتقاط خلايا بركنجي لتسلسل الحمض النووي الريبي اللاحق. يفترض هذا القسم أن المستخدم على دراية بمجهر التقاط ليزر الأشعة فوق البنفسجية والبرامج التابعة.
- قم بتنظيف مرحلة المجهر وذراع تجميع الغطاء باستخدام مزيل التلوث RNase.
- بأيدي مرتدية القفازات ، ضع الشريحة على المجهر وغطاء معتم سعة 500 ميكرولتر في ذراع التجميع.
ملاحظه: تأكد دائما من تقنية الحمض النووي الريبي المناسبة عن طريق تنظيف منطقة العمل باستخدام مزيل التلوث RNase واستخدام الأيدي التي ترتدي القفازات أثناء لمس الشريحة أو الغطاء غير الشفاف. يمكن إزالة القفازات بمجرد وضع الشريحة والغطاء في مكانهما وبدء الالتقاط بالليزر.
- عند التكبير المنخفض ، قم بمحاذاة الغطاء غير الشفاف فوق الأنسجة المخيخية ، مع التأكد من أن الغطاء يغطي المنطقة بأكملها التي تظهر في العدسة العينية.
ملاحظه: ستظهر عدسة المجهر فقط ما إذا كان الغطاء غير الشفاف في المنتصف. لن تظهر الكاميرا ما إذا كان الغطاء متمركزا فوق المنديل. اعتمادا على تصميم نطاق التقاط الليزر ، سيكون التصور من خلال الغطاء غير الشفاف إما في العدسة العينية فقط أو يتم تصوره في كل من العدسة والكاميرا.
- تصور الطبقات المخيخية باستخدام عدسة موضوعية 5x - 10x وضع المؤشر فوق القسم الذي تتقاطع فيه الطبقة الجزيئية وطبقة الخلية الحبيبية (طبقة خلية بركنجي).
- انتقل إلى 40X وتصور خلايا بركنجي.
ملاحظه: انظر الشكل 1 والشكل 2 للحصول على التصورات على سبيل المثال.
- ابدأ في التقاط خلايا بركنجي.
ملاحظه: مطلوب ما لا يقل عن 5 نانوغرام من الحمض النووي الريبي لإجراء تسلسل الحمض النووي الريبي. ينتج ما يقرب من 1600-2000 خلية بركنجي ما يكفي من مادة الحمض النووي الريبي للتسلسل. سيكون الحمض النووي الريبي مستقرا لمدة تصل إلى 8 ساعات في المجهر. اختبر طاقة الأشعة فوق البنفسجية وتركيز الأشعة فوق البنفسجية قبل التجميع للتأكد من صحة المستويات. بمرور الوقت ، ستستمر الأنسجة في الجفاف ، وقد تحتاج طاقة الأشعة فوق البنفسجية وتركيز الأشعة فوق البنفسجية إلى التغيير.
