$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.
1. تخزين الأدمغة
- قم بإزالة الأدمغة بسرعة من الفئران البرية البالغة CD1 التي تم قتلها رحيما والتي تزن حوالي 30 جراما باستخدام نهج تقليدي وقم بالتجميد السريع لمدة 60 ثانية إما في النيتروجين السائل أو الأيزوبنتان المبرد مسبقا بالثلج الجاف.
- قم بتخزين الأدمغة المجمدة عند -80 درجة مئوية في رقائق الألومنيوم أو الأنابيب المخروطية حتى الاستخدام.
2. إعداد مصفوفة الدماغ
- قبل أربع وعشرين ساعة من تشريح الأنسجة ، ضع مصفوفة دماغ نظيفة على كومة من عبوات الفريزر المذابة. ضع جوانب المصفوفة بين عبوتين من الفريزر مع التأكد من ترك حوالي 0.5 سم بين الجزء السفلي من فتحات الحلاقة والجزء العلوي من عبوات الجل ( الشكل 1 أ ). ضع رقائق الألومنيوم على الأطراف للمساعدة في التبريد.
ملاحظة : عند شراء مصفوفة دماغية ، قم بشراء مصفوفة كبيرة بما يكفي لتغليف الحجم الكامل للدماغ المراد تشريحه.
- ضع الصندوق الذي يحتوي على مصفوفة الدماغ وعبوات الفريزر في فريزر -20 درجة مئوية مع فتح الجزء العلوي طوال الليل.
3. إعداد صفيحة زجاجية مجمدة
ملاحظة : الغرض من هذا الإعداد هو إعداد سطح متجمد لتشريح أقسام الدماغ عليه.
- ضع الثلج في صندوق معزول يصل إلى حوالي 5 سم من الأعلى. ثم ضع طبقة 2.5 سم من الثلج الجاف فوق الجليد وقم بتغطيتها بأغطية بلاستيكية سوداء للمساعدة في تصور العينة ( الشكل 1 ب ، الشكل 1 ج ).
- ضع لوحا زجاجيا (يجب أن يتناسب مع فتحة الصندوق) فوق البلاستيك وضع الثلج الجاف فوق اللوحة في الزوايا البعيدة ( الشكل 1C ).
- خذ مصفوفة الدماغ المجمدة من الفريزر وأدخل الدماغ ليتم قطعه من جانب القشرة لأعلى. اتركه يتوازن مع درجة الحرارة في الصندوق لمدة 10 دقائق. احتفظ بالغطاء على الصندوق خلال هذا الوقت.
- اضبط موضع الدماغ في المصفوفة باستخدام ملقط بارد بحيث يصطف الجيوب الأنفية السهمية والجيب المستعرض مع الأخاديد العمودية للكتلة ( الشكل 1D ). سيساعد هذا في ضمان الأقسام المتماثلة لتسهيل التشريح. المس أطراف الملقط لتجفيف الثلج لفترة وجيزة ليبرد قبل ضبط الدماغ.
- بمجرد أن يصبح الدماغ في موضعه ، ضع شفرة حلاقة مبردة بالقرب من مركزها واضغط على الشفرة حوالي 1 مم في الأنسجة. أضف شفرات مبردة إلى الأطراف المنقارية والذيلية للمساعدة في تثبيت الدماغ في مكانه ( الشكل 2 أ و الشكل 2 ب ).
- بدءا من الطرف المنقاري ، أضف الشفرات واحدة تلو الأخرى ، وضعها في الفتحات واضغط عليها برفق لأسفل في الأنسجة حوالي 1 مم ( الشكل 2 ب ). استمر في إضافة شفرات على فترات 1 مم تعمل نحو النهاية الذيلية.
- تأكد من أن الدماغ لا يتحول خلال هذا الوقت. محاذاة الشفرات أفقيا وعموديا ( الشكل 2 ب ). يمكن استخدام شفرات ميكروتوم منخفضة المستوى لتقطيع الأقسام إلى عرض 0.5 مم. ضعها بين شفرات الحلاقة الأكبر حجما ( الشكل 2C ).
- بمجرد وضع الشفرات في مكانها ، اضغط لأسفل فوق المجموعة بالأصابع أو راحة اليد أو أي سطح مستو آخر ( الشكل 2C ، الشكل 2D ). هز مجموعة الشفرات ببطء من جانب إلى آخر لتحريكها عبر الأنسجة.
ملاحظة: قد يستغرق هذا بعض الوقت (1-2 دقيقة) ويتطلب الصبر. يجب أن تكون هناك مقاومة للشفرات التي تتحرك عبر الأنسجة. يعني الدخول السهل أن الدماغ يذوب ويجب تبريد الكتلة بالثلج الجاف.
- عندما تصل جميع الشفرات إلى أسفل الفتحات ، أمسك كل جانب من مجموعة الشفرات والصخور ذهابا وإيابا للعمل بدون مصفوفة.
ملاحظة: توخي الحذر لتجنب جرح نفسك على الحواف الحادة للشفرات.
- بمجرد أن تصبح المجموعة خالية ، ضع المكدس ، الجانب المنقاري لأعلى ، على اللوحة الزجاجية ( الشكل 2E ). ضع الثلج الجاف بجوار و / أو أعلى المكدس لتجميد العينات لتسهيل الفصل.
- ضع المكدس ذو الحواف الحادة لأسفل على اللوح الزجاجي وفصل الشفرات عن طريق تحريك المكدس بين الإبهام والأصابع. يجب أن تنفصل الشفرات عن بعضها البعض مع توصيل أقسام.
- اصطف الأقسام على اللوحة الزجاجية من المنقارية إلى الذيلية ( الشكل 2F ).
- افصل الأنسجة عن الشفرات عن طريق ثني الشفرات بين الأصابع ، أو عن طريق الفصل بشفرة حلاقة باردة ثانية ( الأشكال 2G ، 2H ، 2I ).
4. تشريح الأقسام
- افتح أطلس دماغ ألين ماوس أو مرجع آخر وابحث عن المعالم اللازمة لتحديد مناطق الاهتمام. تشمل بعض المعالم الواضحة التفويض الأمامي ، والجسم الثفني ، والبطينين الجانبيين ، والحصين ( الشكل 3 ).
- اقلب القسم المراد قطعه بالملقط المبرد وتأكد من أن المنطقة التي على وشك الجمع متسقة طوال الوقت. أثناء الحصاد ، استشر الأطلس المرجعي كثيرا لضمان الحصول على عائد الاستثمار الصحيح.
ملاحظة : غالبا ما يكون العدسة المكبرة أو المجهر التشريحي مفيدا في هذه العملية. الإضاءة الجيدة ضرورية أيضا. يمكن استخدام مصابيح LED منخفضة القوة الكهربائية أو مصباح بارد لهذا الغرض.
- باستخدام مشرط أو لكمة نظيفة ، قم بقص القسم ( الشكل 4 ). قم بتبريد كل أداة قبل القطع عن طريق لمسها لفترة وجيزة لتجفيف الثلج. ادفع الشفرة برفق ولكن بقوة في المنديل ، وهزها ذهابا وإيابا لإجراء القطع. لا تضغط بقوة وإلا ستنكسر الأنسجة.
ملاحظة: سوف ترتفع درجة حرارة الأدوات بمرور الوقت. يمكن أن تساعد الشفرات الدافئة قليلا في عمل جروح نظيفة والحد من التكسير ، ولكن احرص على تجنب ذوبان الأنسجة. تبريد الأدوات بشكل دوري على الجليد الجاف.
- بمجرد حصاد عائد الاستثمار ، ضعه في أنابيب مسبقة التحمل ومبردة مسبقا سعة 1.5 مل. قم بتخزين المناديل المحصودة في درجة حرارة -80 درجة مئوية لحين الحاجة.
