إنشاء نموذج لزراعة الأعضاء لمحاكاة مرض القرص الفقري في المرحلة المبكرة

الملخص

المصدر: Saravi، B. et al., نموذج لزراعة الأعضاء التنكسي المسبب للالتهابات لمحاكاة مرض القرص الفقري في المرحلة المبكرة. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو تطوير نموذج ثقافة الأعضاء المؤيد للالتهابات والتنكسية لمرض القرص الفقري في المرحلة المبكرة (IVD) باستخدام عامل نخر الورم α. يحدد إجراء حقن عامل نخر الورم α في القرص الفقري ويشرح الآليات التي من خلالها يتسبب عامل نخر الورم α في التهاب وتدهور الأنفاب.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< p class = "jove_title" >1. ثقافة القرص الفقري (IVD) والتحميل

1. نقل الأقراص الفقرية (IVDs) إلى غرف IVD وإضافة وسط ثقافة IVD (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM ، 4.5 جم / لتر نسبة عالية من الجلوكوز DMEM للمجموعة الفسيولوجية و 2 جم / لتر منخفض الجلوكوز DMEM للمجموعة المرضية) + 1٪ بنسلين / ستربتومايسين + 2٪ مصل ربلة الساق الجنينية + 1٪ ITS (يحتوي على 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين ، 6 ميكروغرام / مل ترانسفيرين ، و 5 نانوغرام / مل حمض سيلينيوس) + 50 ميكروغرام / مل أسكوربات -2-فوسفات + 1٪ حمض أميني غير أساسي + 50 ميكروغرام / مل عامل مضاد للميكروبات للخلايا الأولية) وضعه في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 85٪ رطوبة و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. زراعة الأقراص لمدة 4 أيام داخل نظام المفاعل الحيوي وفقا للمجموعات التجريبية. في المجموعة المرضية ، حافظ على ظروف التحميل التنكسية عند 0.32-0.5 ميجا باسكال ، 5 هرتز لمدة 2 ساعة / يوم. في مجموعة التحكم الفسيولوجية ، استخدم بروتوكول تحميل من 0.02-0.2 ميجا باسكال ، 0.2 هرتز لمدة 2 ساعة / يوم.
   ملاحظه: ضع أجهزة IVD في غرف تحتوي على 5 مل من وسط IVD أثناء إجراءات التحميل. يعتمد الحجم على حجم غرف تحميل المفاعل الحيوي. بين إجراءات التحميل ، ضع أجهزة IVD في ألواح من ستة آبار مع 7 مل من وسط زراعة IVD لاستعادة التورم الحر.
3. لتحليل التغيرات في ارتفاع القرص خلال الفترة التجريبية ، قم بقياس ارتفاع القرص باستخدام الفرجار بعد تشريح IVD (خط الأساس) ثم يوميا بعد فترة التورم الحر وبعد التحميل الديناميكي للمدة التجريبية.

< p class = "jove_title" >2. حقن عامل نخر الورم داخل القرص - ألفا (TNF-α)

1. مباشرة بعد دورة التحميل الديناميكية الأولى في اليوم الأول ، ضع IVDs في طبق بتري في وضع رأسي وقم بتثبيت IVDs باستخدام ملقط
.
2. حقن عامل نخر الورم المؤتلف α (100 نانوغرام في 70 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لكل IVD) بإبرة أنسولين قياس 30 في أنسجة النواة اللبية للمجموعة المرضية. حقن ببطء بسرعة حوالي 70 ميكرولتر في 1 دقيقة.
3. بعد الحقن ، اسحب المحقنة في منتصف الطريق للخلف داخل IVD واسحب مكبس المحقنة لإنشاء فراغ يمنع المحلول المحقون من التسرب للخلف قبل إزالة الإبرة والحقنة تماما من IVD.
   ملاحظة: قم بإجراء تجربة تجريبية عن طريق حقن PBS الذي يحتوي على صبغة التريبان الزرقاء لتقييم توزيع المحلول المحقون بعد التحميل والثقافة الليلية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أسكوربات -2 فوسفات	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكية	A8960
TNF-alpha ، بروتين بشري مؤتلف	أنظمة البحث والتطوير ، مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية	210-TA-005
بقري IL-8 افعل بنفسك إليزا	Kingfisher Biotech ، سانت بول ، الولايات المتحدة الأمريكية	DIY1028B-003
كورنينج آيتس بريميكس	شركة كورنينج ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية	354350
ارتفاع نسبة الجلوكوز DMEM	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	10741574
DMEM منخفض الجلوكوز	جيبكو من لايف تكنولوجيز ، كارلسباد ، الولايات المتحدة الأمريكية	11564446
الإيثانول للبيولوجيا الجزيئية	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكية	09-0851
مصل الأبقار الجنينية (FBS)	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	A4766801
محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية	جيبكو من لايف تكنولوجيز ، كارلسباد ، الولايات المتحدة الأمريكية	11140050
البنسلين / الستربتومايسين (P / S)	gibco by life technologies, Carlsbad, USA	11548876
محلول عازلة الفوسفات، قرص	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكية	P4417
بريموسين	InvivoGen, Sandiego, USA	ant-pm-05