الحصول على معلق أحادي الخلية من أنسجة دماغ الفئران المجمدة

الملخص

المصدر: Rubio, F. J., et . al. فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) وتحليل التعبير الجيني للخلايا العصبية التي تعبر عن Fos من أنسجة دماغ الفئران الطازجة والمجمدة. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو تفكك أنسجة دماغ الفئران المجمدة إلى معلق أحادي الخلية باستخدام الهضم الأنزيمي والتجربة الميكانيكية. يتم تثبيت الخلايا المحضرة ونفاذها بالإيثانول للتطبيقات النهائية مثل قياس التدفق الخلوي أو تحليل التعبير الجيني.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية والمراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. التحضير قبل جمع الأنسجة

1. اضبط جهاز الطرد المركزي على 4 ^درجاتمئوية.
2. تلميع مجموعة من ثلاث ماصات باستور زجاجية بأقطار متناقصة تبلغ حوالي 1.3 و 0.8 و 0.4 مم لكل عينة.
3. قم بإعداد أنابيب مسمى 1.7 مل تحتوي على 1 مل من العازلة الباردة A واحتفظ بالأنابيب على الجليد.
4. قم بإعداد صينية ثلج تحتوي على مصفوفة تقطيع الدماغ والملاعق والأطباق الزجاجية (أو طبق بتري الزجاجي المقلوب) لإجراء التشريح عليها. قم بتبريد شفرات حلاقة أو أكثر مسبقا على الألواح الزجاجية واستخدم المناديل الورقية لتجفيف جميع الأدوات التي تلامس الأنسجة.
5. قم بإذابة محلول الإنزيم في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة قبل جمع الأنسجة.

< p class = "jove_title" >2. جمع الأنسجة وتشريحها

1. ابدأ العلاج السلوكي أو الدوائي قبل 90 دقيقة من جمع الأنسجة.
   ملاحظه: بالنسبة للنتائج الموضحة هنا ، تم إجراء حقن حادة داخل الصفاق بمقدار 5 مجم / كجم من الميثامفيتامين على الفئران في بيئة جديدة (حالة الاختبار) والجرذان الساذجة المحفوظة في أقفاص منزلها (حالة التحكم).
2. قم بتخدير الجرذ عن طريق وضعه في وعاء مجفف زجاجي مع الأيزوفلوران المشبع وقطع رأس الجرذ بعد 30 - 60 ثانية باستخدام المقصلة.
   استخدم المقص لإزالة الجلد والعضلات من الرأس وفضح الجمجمة. استخدم rongeurs لقطع الجمجمة ، وفتح الثقبة الماغنوم ، وإزالة الجزء الخلفي من الجمجمة. استخدم rongeurs لقطع الحواف العلوية للجمجمة لفضح الدماغ. احرص على عدم إتلاف الدماغ. استخدم ملعقة صغيرة لغرف الدماغ برفق ورفعه. ارفع الدماغ وقطع الأعصاب حتى يتحرر الدماغ.
3. تشريح الأنسجة باستخدام شفرات الحلاقة.< / > ملاحظه: الحصول على عينات من الأنسجة باستخدام أي من الطرق التالية: (2.3.1) الأنسجة التشريح حديثا. (2.3.2) الأنسجة المجمدة بعد التشريح ؛ أو (2.3.3) الأنسجة المجمدة التي تم تشريحها من الدماغ الكامل المجمد. حافظ على جفاف مصفوفة تقطيع الدماغ وشفرات الحلاقة والصفيحة الزجاجية طوال عمليات التشريح والفرم لأن الماء المكثف يمكن أن يؤدي إلى تحلل الخلايا بنقص توتر. استخدم النظارات المكبرة لضمان التشريح الدقيق.
   1. بالنسبة للأنسجة التي تم تشريحها حديثا ، ضع الدماغ المستخرج حديثا في مصفوفة تقطيع الدماغ (قالب معدني على شكل دماغ فأر مع فتحات لشفرات الحلاقة على فترات 1 مم) تم تبريدها على الجليد. أدخل شفرات حلاقة مبردة مسبقا أو أكثر في الفتحات لقطع الشرائح الإكليلية التي تحتوي على منطقة (مناطق) الدماغ ذات الأهمية. ضع الشريحة المقطوعة على الطبق الزجاجي المبرد.
      ملاحظة: قم بتشريح مناطق الدماغ ذات الأهمية على طبق زجاجي مبرد.
   2. بالنسبة للأنسجة المجمدة بعد التشريح ، قم بتشريح منطقة (مناطق) الدماغ ذات الأهمية من شرائح الدماغ المستخرجة حديثا ، على غرار تلك الموضحة أعلاه في 2.3.1. ضع الأنسجة المقطعة في أنبوب دقيق وقم بتجميد الأنسجة بسرعة عن طريق غمر الأنبوب الدقيق في -40 درجة مئوية من الأيزوبنتان لمدة 20 ثانية. احتفظ بالأنسجة المقطوعة مجمدة في جميع الأوقات في فريزر -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
   3. بالنسبة للأنسجة المجمدة ، قم بتجميد الدماغ المستخرج حديثا على الفور في -40 درجة مئوية من الأيزوبنتان وتخزينه في كيس محكم الغلق عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
      1. في يوم التشريح ، ضع الدماغ المتجمد في ناظم ناظم على درجة حرارة تصل إلى -20 درجة مئوية تقريبا (لا تزيد درجة الحرارة عن -18 درجة مئوية) لمدة ساعتين تقريبا لموازنة درجة الحرارة.
         ملاحظه: يمكن قطع الأدمغة بسهولة عند درجة الحرارة هذه ، في حين أن درجات الحرارة الأكثر برودة تجعل الدماغ هشا جدا بحيث لا يمكن قطعه بأمان.
      2. استخدم شفرات الحلاقة لقطع شرائح إكليلية من 1 إلى 2 مم من الأدمغة المجمدة في ناظم البرد. في ظل ظروف التجمد ، استخدم إبرة ضعيفة من 12 إلى 16 للحصول على لكمات الأنسجة من هذه الشرائح. حافظ على تشريح الأنسجة المجمدة في جميع الأوقات حتى مزيد من المعالجة.
   4. أضف 1-2 قطرات من العازلة أ لتغطية الأنسجة المقطوعة قبل الفرم. قم بإزالة معظم المادة البيضاء من الأنسجة باستخدام شفرات حلاقة لمنع فقدان الخلايا العصبية أثناء بقية عملية التخليص. إذا بدأت بأنسجة مجمدة ، اترك الأنسجة تذوب على اللوح الزجاجي البارد لمدة لا تزيد عن 1 دقيقة قبل تطبيق محلول Buffer A.
   5. افرم الأنسجة 100 مرة في كل اتجاه متعامد بشفرة حلاقة على لوح زجاجي مبرد. أمسك شفرة الحلاقة عموديا على اللوح الزجاجي عند الفرم
      ملاحظه: يعد الفرم الشامل أمرا بالغ الأهمية لجميع خطوات البروتوكول.
   6. استخدم شفرات الحلاقة لنقل الأنسجة المفرومة إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على 1 مل من العازلة الباردة أ. اقلب الأنبوب 3-5 مرات للحفاظ على جميع الأنسجة المفرومة في المحلول.

< p class = "jove_title" >3. تفكك الخلية

ملاحظة: استخدم الخلط اللطيف على الطرف لجميع الخطوات التالية. لا تستخدم الخلاط الدوامي وتجنب فقاعات الهواء التي تسبب تلف الخلايا.

1. جهاز الطرد المركزي لأنابيب العينة عند 110 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. أضف ببطء 1 مل من محلول الإنزيم البارد المذاب حديثا (الذي يحتوي على مزيج من الإنزيمات المحللة للبروتين) أسفل الجدار الداخلي للأنبوب الصغير. امتص الحبيبات بأكملها على الفور وقم بسحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل 4 مرات فقط باستخدام ماصة بقطر طرف كبير إلى حد ما لتفريق حبيبات الأنسجة المفرومة.
2. اقلب الأنابيب الدقيقة على الفور لمنع الحبيبات من الالتصاق بالقاع, واحتضان العينات بالخلط النهائي لمدة 30 دقيقة عند 4 ^درجاتمئوية.
3. بعد هضم الأنسجة الأنزيمية ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 960 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 0.6 مل من العازلة الباردة A. مباشرة بعد إضافة Buffer A ، استخدم نفس طرف الماصة لتفريق الحبيبات عن طريق امتصاص الحبيبات بأكملها والماصة برفق لأعلى ولأسفل 5 مرات.
4. قم بتقطيع الأنسجة المهضومة ميكانيكيا وجمعها في أنابيب سعة 15 مل باستخدام الخطوات التالية. لكل عينة، استخدم مجموعة منفصلة من 3 ماصات باستور زجاجية مصقولة بالحريق بأقطار تنازلية تبلغ حوالي 1.3 و0.8 و0.4 مم متصلة بمصابيح اللاتكس.
   1. قم بترتيتر كل عينة برفق 10 مرات باستخدام الماصة الزجاجية مقاس 1.3 مم. دع العينة تستقر لمدة دقيقتين على الجليد (سوف يستقر الحطام والخلايا غير المنفصلة في القاع). اجمع المادة الطافية (~ 0.6 مل) وانقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل (أنبوب # 1).
   2. أضف 0.6 مل محلول Buffer A إلى الحبيبات المتبقية. قم بترتيبات العينة 10 مرات باستخدام الماصة الزجاجية 0.8 مم. دع العينة تستقر لمدة دقيقتين على الجليد. اجمع المادة الطافية (~ 0.6 مل) وانقله إلى نفس الأنبوب المخروطي سعة 15 مل # 1.
   3. أضف 0.6 مل محلول Buffer A إلى الحبيبات المتبقية. قم بترتيث العينة 10 مرات باستخدام الماصة الزجاجية 0.4 مم. دع العينة تستقر لمدة دقيقتين على الجليد. اجمع المادة الطافية (~ 0.6 مل ؛ دون لمس الحبيبات بخلايا غير منفصلة) وانقلها إلى نفس الأنبوب المخروطي سعة 15 مل # 1.
      ملاحظه: احتفظ بالماصة التي يبلغ قطرها 0.4 مم في الأنبوب #1 لخطوات التجربة التالية.
   4. كرر الخطوة 3.4.3 ثلاث مرات أخرى باستخدام أصغر ماصة زجاجية (قطرها ~ 0.4 مم)، واجمع المادة الطافية في أنبوب مخروطي منفصل سعة 15 مل (أنبوب #2).
   5. قم بترتيث معلقات الخلايا المجمعة في الأنبوبين # 1 و # 2 لمدة 10 مرات أخرى باستخدام الماصة الزجاجية 0.4 مم واحتفظ بها على الجليد.

< p class = "jove_title" >4. تثبيت الخلية ونفاذيتها

1. قم بإعداد 4 أنابيب دقيقة لكل عينة (أنبوبان دقيقان للخلايا من الأنبوب # 1 واثنان للخلايا من الأنبوب # 2) عن طريق إضافة 800 ميكرولتر من الإيثانول البارد بنسبة 100٪ (المخزن عند -20 ^{درجة مئوية}قبل الاستخدام) في كل أنبوب واحتفظ بها على الجليد. ملاحظة: سيكون تركيز الإيثانول النهائي 50٪.
2. الماصة ~ 800 ميكرولتر من معلقات الخلية (من الأنبوب # 1 والأنبوب # 2) في كل من الأنابيب الأربعة التي تحتوي على الإيثانول البارد وعكس الأنابيب لخلط العينات.
3. احتضان الأنابيب على الجليد لمدة 15 دقيقة مع قلب الأنابيب كل 5 دقائق.
4. بعد التثبيت / النفاذية ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 1,700 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. اترك 50 ميكرولتر من المحلول لمنع فقدان الخلايا.
   ملاحظه: الكريات في هذه المرحلة بيضاء وتلتصق بجدار الأنابيب أقل مما كانت عليه قبل النفاذية. لذلك ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق لمس جدار الأنبوب الدقيق حيث لا توجد حبيبات واسحب المادة الطافية ببطء باستخدام ماصة دقيقة.

< p class = "jove_title" >5. ترشيح الخلايا

1. أعد تعليق الكريات من الخطوة 4.4 باستخدام PBS البارد على النحو التالي:
   1. أضف 550 ميكرولتر من PBS البارد إلى أحد الأنبوبين الدقيقين القادمين من الأنبوب #1، واستخدم طرف ماصة بقطر متوسط لتحريك تعليق الخلية برفق لأعلى ولأسفل 5 مرات. كرر نفس الشيء مع أنبوب دقيق واحد قادم من الأنبوب # 2.
   2. بالنسبة للخلايا من الأنبوب # 1 ، باستخدام نفس الماصة ، انقل تعليق الخلية الأولى إلى الحبيبات الثانية. أعد تعليق الحبيبات الثانية عن طريق سحب تعليق الخلية المركب برفق لأعلى ولأسفل 5 مرات.
   3. بالنسبة للخلايا من الأنبوب #2, إعادة تعليق الكريات ودمجها (بمعنى آخر., الأنابيب الدقيقة الثالثة والرابعة) كما هو موضح في 5.1.2.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مصفوفة الدماغ	سيل بوينت العلمي	69-2160-1	للحصول على شرائح الدماغ الإكليلية
السبات مضان منخفض	بتات الدماغ	HA-lf	يستخدم Buffer A' في البروتوكول لمعالجة الأنسجة والخلايا من خطوات التفكك إلى التثبيت
أكوتازي	ميليبوري	SCR005	يستخدم محلول الإنزيم في البروتوكول للهضم الأنزيمي للأنسجة قبل التجربة
مصفاة الخلية ، 40 ميكرومتر	BD Falcon	352340	لتصفية تعليق الخلية
مصفاة الخلية، 100 ميكرومتر	BD Falcon	352360	لتصفية تعليق الخلية
فالكون 5 مل أنبوب اختبار البوليسترين دائري القاع مع غطاء مصفاة الخلية	BD العلوم البيولوجية	352235	لتصفية تعليق الخلية قبل تمرير مقياس التدفق الخلوي
باستور بيبيت ، زجاج	توريد المعاهد الوطنية للصحة	6640-00-782-6008	للقيام بتجربة الأنسجة