$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.
< p class = "jove_title" >
1. تحضير أغشية دماغ الفأر
- اقطع رأس الفأر باستخدام جهاز المقصلة وقم بتشريح الدماغ بسرعة (في <1 دقيقة ، إن أمكن ، لتقليل تغيرات البالميتويل التي قد تحدث أثناء إجراء التشريح). تجانس على الفور في 10 مل من مخزن التجانس (الجدول 1) في الخالط الزجاجي (~ 12 ضربة) على الجليد.
- تعمل أجهزة الطرد المركزي على التحلل لمدة 15 دقيقة عند 1,400 × جم عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد على الجليد. أعد تعليق الحبيبات (~ 6 ضربات) في حجم متساو من مخزن التجانس والطرد المركزي عند 710 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- اجمع بين المواد الطافية من الخطوة 1.2 وأجهزة الطرد المركزي عند 40,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من المادة الطافية (الجزء العصاري الخلوي) وأعد تعليق جزء الغشاء المحبب (P2) في المخزن المؤقت للتجانس.
ملاحظه: يمكن تجميد العينات وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
- إجراء اختبار حمض البيسنكونينيك (BCA) لتحديد مستويات البروتين. بالنسبة لمقايسة إزاحة هلام تبادل Acyl-PEGyl (APEGS) ، ابدأ ب ~ 100-200 مجم بروتين (بحد أقصى 250 مجم) بحجم 470 ميكرولتر من المخزن المؤقت A (الجدول 1) في أنبوب 1.5 مل. صوتيا وأجهزة الطرد المركزي عند >13,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية لإزالة البروتين غير القابل للذوبان. نقل البروتين المذاب إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
< p class = "jove_title" >
2. مقايسة إزاحة هلام تبادل Acyl-PEGyl (APEGS)
- تعطيل روابط ثاني كبريتيد ومنع السيستين الحرة.
- تعطيل روابط ثاني كبريتيد عن طريق احتضان 25 ملي مولار تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين (TCEP ؛ 25 ميكرولتر ، مضاف من محلول مخزون ؛ الجدول 1) لمدة 60 دقيقة عند 55 درجة مئوية.
- كتلة السيستين الحرة مع 50 ملي مولار N-ethylmaleimide (NEM ؛ 12.5 ميكرولتر ، مضاف من محلول مخزون ؛ الجدول 1) في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات < / >
ملاحظه: يمكن تمديد رد الفعل بين عشية وضحاها.
- قم بإجراء ترسيب الميثانول الكلوروفورم (CM).
- انقل محلول البروتين من أنبوب سعة 1.5 مل إلى أنبوب بولي بروبيلين أو زجاج يمكن طرده في دوار دلو متأرجح بسرعة متواضعة. أنبوب 5 مل مثالي. أضف أربعة مجلدات (2 مل) من الميثانول (MeOH) والدوامة لفترة وجيزة.
- أضف مجلدين (1 مل) من الكلوروفورم والدوامة لفترة وجيزة.
- أضف ثلاثة أحجام (1.5 مل) من الماء منزوع الأيونات (dH2O) والدوامة لفترة وجيزة.
- الطرد المركزي للعينات عند 3,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية في دوار دلو متأرجح.
- قم بإزالة المرحلة العليا وتجاهلها بعناية.
- أضف 3 أحجام (1.5 مل) من MeOH واخلطها برفق ولكن جيدا ، مع الحرص على عدم تجزئة فطيرة البروتين غير الشفافة.
- جهاز طرد مركزي عند 3,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية في دوار دلو متأرجح.
- باستخدام ماصة مصلية زجاجية ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المرحلة العلوية دون إزعاج فطيرة البروتين.
- اشطف الحبيبات بعناية ب 1 مل من MeOH.
- جفف الحبيبات بالهواء لمدة لا تقل عن 10 دقائق
ملاحظه: يمكن تخزين الحبيبات المجففة عند -20 درجة مئوية.
- قم بإجراء انقسام روابط بالميتويل ثيوستر مع هيدروكسيلامين (NH2OH ، HAM).
- أعد تعليق ترسيب البروتين في 125 ميكرولتر من العازلة A وصوتنة لفترة وجيزة. جهاز طرد مركزي عند >13,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية لإزالة المواد غير القابلة للذوبان. نقل البروتين المذاب إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
- أضف 375 ميكرولتر من المخزن المؤقت H (HAM + ؛ الجدول 1) أو المخزن المؤقت T (HAM-; الجدول 1) واحتضان العينات لمدة 60 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
- كرر هطول الأمطار CM الموصوف في الخطوة 2.2.
ملاحظه: يمكن تخزين الحبيبات المجففة عند -20 درجة مئوية.
- أضف mPEG إلى السيستين غير المحمي.
- أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت A الذي يحتوي على 10 ملي مولار TCEP. نقل إلى أنبوب سعة 1.5 مل
ملاحظه: من الطبيعي أن يحدث فقدان كبير للبروتين أثناء خطوات هطول الأمطار. سيتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في أنبوب سعة 1.5 مل ، مما يحد من حجم البروتين بحد أقصى ~ 120-130 ميكرولتر. سيؤدي ذلك إلى تقليل فقدان البروتين أثناء هطول الأمطار النهائي CM.
- أضف 20 ملي مولار mPEG-5k (25 ميكرولتر ، مضاف من محلول مخزون ؛ الجدول 1) لعينة البروتين وخلطها عن طريق سحب العينات. احتضن لمدة 60 دقيقة عند 25 درجة مئوية مع دوران من طرف إلى طرف.
- لإزالة mPEG-5k غير مدمج ، قم بإجراء ترسيب CM كما هو موضح في الخطوة 2.2 باستخدام هذه الأحجام المعدلة: 4 أحجام من MeOH (500 ميكرولتر) ، ومجلدان من الكلوروفورم (250 ميكرولتر) ، و 3 أحجام من dH2O (375 ميكرولتر). جهاز طرد مركزي عند >13,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية.
- قم بإزالة المرحلة العليا بعناية كما كان من قبل ، وتجنب الفطيرة السميكة والندفية. أضف 1 مل من MeOH واخلطه برفق ولكن جيدا. جهاز طرد مركزي عند >13,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية.
- قم بإزالة المادة الطافية بعناية واشطف الحبيبات ب 1 مل من MeOH. جهاز طرد مركزي عند >13,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية><.
ملاحظه: يمكن تخزين الحبيبات المجففة عند -20 درجة مئوية.
- أعد تعليق الحبيبات المجففة في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت A (بدون TCEP أو أي عامل اختزال).