تصنيع ميكروبيدات البوليمر التي تطلق الأميلويد بيتا لنمذجة مرض الزهايمر

الملخص

المصدر: Almari, B., et al. تصنيع ميكروبيدات الألجينات التي تفرز β الأميلويد لاستخدامها في نمذجة مرض الزهايمر. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو طريقة لتصنيع ميكروبيدات البوليمر التي تغلف خلايا إفراز أميلويد بيتا السامة للأعصاب. تتم معالجة معلق الخلية والبوليمر من خلال جهاز تصنيع الميكروبيدات ، مع هلام البوليمر الذي يتم تحقيقه عن طريق الربط المتقاطع للكالسيوم ، وتشكيل حبيبات ميكروبية كروية حول الخلايا. يسمح البوليمر بتكاثر الخلايا مع السماح بإطلاق أميلويد بيتا المتحكم فيه على المدى الطويل ، مما يحاكي تراكمه في مرض الزهايمر.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الاستعدادات

1. تحضير 100 مل من ~ 4٪ (وزن / حجم) محلول مخزون الجينات.
   1. يزن 4.4 جم من ملح الألجينات الصوديوم ويضاف المسحوق الجاف إلى 100 مل من محلول ملحي مخزن ب HEPES (HBS ، 20 ملي هيدروكسي إيثيل بيبرازين حمض السلفونيك [HEPES] (0.477 جم) مع 150 ملي كلوريد الصوديوم (0.877 جم) في الماء منزوع الأيونات مما يسمح بالترطيب.
   2. استخدم أداة تقليب مغناطيسية عند ~500 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة) وقم بتسخينها حتى 50 درجة مئوية للسماح بترطيب الألجينات الكامل.
      ملاحظه: قد يحتاج الجينات إلى ساعة أو ساعتين ليكون رطبا تماما. لتوفير الوقت ، يمكن تحضير محلول الجينات قبل يوم واحد من بروتوكول التغليف وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى اليوم التالي. عندما يتم تبريد الجينات ، قم بتسخينه برفق إلى 37 درجة مئوية باستخدام حمام مائي أو صفيحة ساخنة وحركه باستخدام محرك مغناطيسي مباشرة قبل الاستخدام.
   قم
   3. بتصفية محلول الجينات المعقم باستخدام مرشح بولي إيثر سلفون المسام 0.22 ميكرومتر (PES) قبل الاستخدام. يوصى بالترشيح عند 37 درجة مئوية للسماح بتدفق سهل للجينات. ستزداد اللزوجة إذا سمح لدرجة الحرارة بالانخفاض.
2. تحضير 1,000 مل من 0.5 م CaCl₂.
   1. تزن 55.49 جم من CaCl₂ اللامائي وتذوب في 1,000 مل من HBS (20 ملي مولار HEPES و 150 ملي كلوريد الصوديوم في 1,000 مل من الماء منزوع الأيونات).
   2. مرشح معقم باستخدام مرشح PES مسام 0.22 ميكرومتر.
3. تحضير 100 مل من مزيج الذوبان.
   1. تحضير محلول هيدرات سترات ثلاثي الصوديوم 100 ملي مولار (23.83 جم) و 500 ملي مولار في محلول ملحي مخزن بالفوسفات.
   2. اضبط على الرقم الهيدروجيني 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك.

2. إعداد نظام التغليف

1. نظف غطاء التدفق الرقائقي.
   1. قم بتعقيم غطاء التدفق الصفحي الذي يحتوي على المغلف باستخدام التعرض للأشعة فوق البنفسجية متبوعا بالرش بمحلول إيثانول بنسبة 70٪ v / v.
   2. اغسل نظام المغلف ب 10 مل من محلول الإيثانول بنسبة 70٪ v / v متبوعا ب 10 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات.
   3. قم بتوصيل الفوهة 300 ميكرومتر وكرر الخطوة 2.1.2.
   4. رش الزجاجة التي تحتوي على محلول الجينات المصفى والزجاجة التي تحتوي على محلول كلوريد الكالسيوم المصفى وأي أدوات ومعدات وألواح استزراع فارغة سيتم استخدامها مع محلول الإيثانول بنسبة 70٪ من القيمة الرأسمالية / الحجمي وضعها في غطاء التدفق الرقائقي. قبل الاستخدام ، قم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية مرة أخرى لمدة 30 دقيقة لتعقيمه تماما.
   5. قم بإعداد دورق نفايات مملوء بمحلول مطهر بيولوجي وضع الدورق في الغطاء.
   6. املأ دورق ب 100 مل من محلول CaCl₂ المعقم (المائي) وأضفه في أداة التحريك المغناطيسية. اضبط سرعة التقليب على 100 دورة في الدقيقة. ضع الدورق على منصة مغناطيسية على ارتفاع 18 سم من طرف الفوهة. سيتم استخدام هذا الدورق لجمع حبات الجينات والسماح بتهلامها.
2. تحضير الخلايا للتغليف.
   1. قم بإزالة الخلايا من الحاضنة وافصلها عن القارورة القريبة من التقاء باستخدام محلول حمض التربسين -إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) بنسبة 0.25٪ واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
   2. اعزل عينة لتقدير كثافة الخلية ثم الطرد المركزي للخلايا المتبقية عند 1,000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق للحصول على حبيبات الخلية.
   3. أعد تعليق الحبيبات في HBS (20 ملي مولار HEPES و 150 ملي كلوريد الصوديوم) لمضاعفة تركيز الخلية النهائي المطلوب (على سبيل المثال ، للتركيز النهائي 1.5 × 10⁶ خلايا / مل ، أعد تعليق الخلايا في HBS لتحقيق تركيز 3 × 10⁶ خلايا / مل).
   4. في أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل ، قم بخلط تعليق الخلية بنسبة 1: 1 مع محلول الجينات ~ 4٪ (وزن / حجم) للحصول على تعليق نهائي يحتوي على تركيز الخلية المطلوب (على سبيل المثال ، 1.5 × 10⁶ خلايا / مل) في محلول ألجينات ~ 2٪ (وزن / حجم).
3. قم بتعيين معلمات التغليف.
   1. اضبط سرعة آلة التغليف على أقصى سرعة بثق (8.9 مل / دقيقة) ، والجهد على 1.0 كيلو فولت والتردد إلى 5,500 هرتز < br / > ملاحظه: تم تحسين هذه المعلمات سابقا للحصول على ميكروبيدات بقطر 550 ميكرومتر.

< p class = "jove_title" >3. تلفيق

1. تصنيع الميكروبيدات.
   1. في حقنة سعة 20 مل ، قم بتحميل 5 مل من تعليق الخلية وقم بتوصيل حقنة بالغلاف.
   2. ابدأ تشغيل المغلف عن طريق تنشيط التدفق الذي سيدفع تعليق الخلية الألجينات عبر وحدة التغذية. سيتم بثق تيار من القطرات من خلال الفوهة.
   3. اجمع أول 1 مل في دورق النفايات لتجنب التيار الأولي غير المنتظم.
   4. استمر في تشغيل 4 مل المتبقية للسماح للقطرات بالسقوط في حمام التبلور CaCl₂. يمكن تشغيل كل مليلتر بشكل منفصل (ولكن على التوالي) وجمعها في أربعة حمامات هلامية مختلفة إذا لزم الأمر.
      ملاحظه: عند ملامسة حمام التبلور ، سوف يرتبط الجينات الموجودة في القطرات على الفور بأيونات الكالسيوم في حمام التبلور وتشكل حبيبات ميكروبية كروية.
   5. بعد دقيقة واحدة ، قم بإزالة دورق التبلور من المنصة المغناطيسية واترك الميكروبيدات بالجلوس لمدة 4 دقائق أخرى دون تحريض (الوقت اللازم للسماح بالتبلور الكامل عبر الميكروبيدات في درجة حرارة الغرفة).
2. استرجاع الميكروبيدات.
   1. قم بإزالة أي حطام أو قطع أثرية كبيرة من الجينات باستخدام زوج من الملقط المعقم ، ثم استخدم ماصة بلاستيكية معقمة لنقلها إلى مرشح شبكي 74 ميكرومتر لاسترداد الميكروبيدات من حمام التبلور.
   2. انقل الميكروبيدات إلى أنبوب طرد مركزي باستخدام وسط الاستزراع المناسب واسمح لها بالتوازن لمدة 5 دقائق في وسط زراعة الخلية.
   3. انقله إلى قارورة أو طبق أو طبق بتري للحضانة والمزيد من التجارب.
      ملاحظه: لا ينبغي إعادة استخدام حمام الهلام.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.22 um PES filter	ميرك ، المملكة المتحدة	SLGP033RS
15 مم Netwell insert 74 um mesh filter	كونستار، الولايات المتحدة الأمريكية	#3477
ملح الصوديوم بحمض الألجنيك من الطحالب البنية	سيجما ألدريتش ، المملكة المتحدة	A0682
كلوريد الكالسيوم	سيجما ألدريتش ، المملكة المتحدة	C1016
مقايسة تكاثر الخلايا CellTiter96 AQueous One Solution	Promega, الولايات المتحدة الأمريكية	G3580
Encapsulator	Inotech	IE-50	الرقم التسلسلي 05.002.01-2005
هيبس	سيجما ألدريتش ، المملكة المتحدة	H4024
محلول ملحي مخزن بالفوسفات	سيجما ألدريتش ، المملكة المتحدة	D1408
كلوريد الصوديوم	سيجما ألدريتش ، المملكة المتحدة	433209
ثلاثي البترول سيترات ثنائي هيدرات	سيجما ألدريتش ، المملكة المتحدة	W302600-K
Trypsin-EDTA solution	سيجما ألدريتش ، المملكة المتحدة	T4049