$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية والمراجعة البيطرية JoVE
ملاحظة: ابدأ بتحديد مجموعة الفئران المستهدفة. في الدراسات السابقة ، تم استخدام ذكور الفئران من النوع البري C57 / Bl6 فقط. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام العديد من الفئران المعدلة وراثيا أو بالضربة القاضية. لاحظ أن الإحداثيات التجسيمية تستند إلى تشريح C57 / Bl6. يوصى بأن يتحقق كل مستخدم في البداية من توطين السكتة الدماغية إلى المادة البيضاء.
< p class = "jove_title" >
1. تحريض السكتة الدماغية للمادة البيضاء - نهج الزاوية الإنسي
- ابدأ بتحضير ماصة زجاجية مسحوبة باستخدام أنبوب شعري 0.5 مم بقطر بعيد بين 15-25 ميكرومتر.
- تحضير كمية معقمة 10 ميكرولتر من L-Nio (N (5) - (1) -iminoethyl-L-ornithine hydrochloride) عند 27.4 مجم / مل (130 ميكرومتر) في محلول ملحي عادي معقم 0.9٪.
- املأ الماصة الزجاجية المسحوبة مسبقا بحجم صغير من L-Nio (2-5 ميكرولتر) عن طريق تثبيت الماصة الزجاجية على الأنابيب المتصلة بخط تفريغ. ضع الماصة بشكل مسطح على سطح المقعد وأدخل الطرف المسحوب في محلول L-Nio.
- ضع المكنسة الكهربائية حتى يتم ملء 2 مم على الأقل من الجزء البالغ 0.5 مم من الماصة. قم بإيقاف تشغيل الفراغ واسحب الماصة. ضعه جانبا حتى الخطوة 1.12.
- ضع الفأر في غرفة الحث وقم بتخدير الفأر باستخدام الأيزوفلوران القياسي بنسبة 32٪ المتدفق عبر المرذاذ (5 لتر / دقيقة يتم استنشاقه مع 5 لتر / دقيقة أكسجين و 0.5 لتر / دقيقة نيتروجين) لمدة 1 دقيقة أو حتى يتم تخديره بعمق. انقل الماوس إلى جهاز تجسيمي مزود بمجهر تجسيمي. توفير تخدير الصيانة باستخدام 32٪ من الأيزوفلوران المتدفق من خلال المرذاذ (2 لتر / دقيقة مستنشقة مع 5 لتر / دقيقة أكسجين و 0.5 لتر / دقيقة نيتروجين) ومخروط الأنف. تحقق من عمق التخدير مع قرصة إصبع القدم.
- اضبط ذراع الحقن على 36 درجة.
- قم بتثبيت حامل ماصة زجاجية مسحوبة على الطرف البعيد لنظام الحقن بالضغط منخفض الحجم وقم بتثبيته بذراع الحقن للإعداد التجسيمي.
- قم بتغطية شعيرات المخدر بالفازلين وضع مرهم اصطناعي للدموع على كلتا العينين. قم بإعداد حقل جراحي معقم عن طريق وضع ستارة معقمة فوق رأس بفتحة 5-10 سم فوق الرأس. قم بإعداد سطح جراحي معقم عن طريق حلق الفراء الذي يغطي الجمجمة. نظف فروة الرأس بالبيتادين بالتناوب ومسحات كحولية 70٪.
- قم بعمل شق خط الوسط لفروة الرأس بطول 1.5 سم بمقص ناعم معقم لكشف سطح الجمجمة. جفف الجمجمة بقطعة قطن معقمة ، وباستخدام مجهر تجسيمي بتكبير 1-3X ، قم بإزالة أي أنسجة سمحاق مغطاة باستخدام أداة معقمة دقيقة.
- ضع علامة على Bregma كنقطة مرجعية باستخدام علامة نقطة دقيقة.
- قم بحفر بضع قحف بيضاوي الشكل بطول 2 مم باستخدام مثقاب جراحي معقم ناعم يبدأ من الخلف عند Bregma ويمتد إلى الأمام على يسار خط الوسط. قم بإزالة شظايا العظام والأنسجة الرخوة المغطاة بحيث يمكن تصور القشرة الدماغية.
- حافظ على رطوبة المجال الجراحي والسطح القشري عن طريق وضع قطرات من المحلول الملحي المعقم بشكل متقطع.
- قم بلصق ماصة زجاجية مسحوبة على ذراع الحاقن للجهاز التجسيمي. قم بمحاذاة الطرف البعيد للماصة مع Bregma وقم بتصفير الإحداثيات التجسيمية.
- ادفع الماصة إلى الإحداثيات الأمامية/الخلفية الأولى (A/P) والإحداثيات الوسطى/الجانبية (M/L) الواردة في الجدول 1.
- ادفع الماصة إلى السطح القشري وقم بصفر القياس الظهري/البطني (D/V).
- مرر الماصة ببطء إلى الدماغ حتى تصل إلى إحداثيات D/V الأولى في الجدول 1.
- باستخدام نظام حقن الضغط منخفض الحجم الضبط على 20 رطل لكل بوصة مربعة لنبضات 20 مللي ثانية ، قم بحقن 100 nl من L-Nio في الدماغ وانتظر 5 دقائق لمنع الارتجاع فوق مسار الماصة.
- استخدم شبكية معايرة في عدسة المجهر التجسيمي وتكبير 3X.
- وفقا لذلك، قم بإزاحة إجمالي 0.100 مم3 (طول 0.5 مم في ماصة قطرها 0.5 مم، أي 100 nl) من الماصة الزجاجية المسحوبة لكل مجموعة من الإحداثيات. باستخدام شبكية ، قم بالقياس والتوحيد القياسي لأن كل إعداد يختلف اعتمادا على التكبير والمقاييس المستخدمة.
- لقياس الحجم بدقة أثناء كل حقنة، اقترب من الماصة الزاوية بالمجهر من الجانب بحيث يكون للمغضروف المفصلي السائل الهوائي رؤية سهمية. يجب أن يظهر الغضروف المفصلي في نفس المستوى البؤري لكل من الجدران الداخلية والخارجية للماصة.
- اسحب الماصة ببطء وكرر الخطوتين 1.13-1.16.3 في المجموعة الثانية والثالثة من الإحداثيات الواردة في الجدول 1.
- بعد الحقن النهائي، قم بإزالة الماصة وضع ما يكفي من شمع العظام لملء موقع حج القحف. تقريب حواف جرح فروة الرأس واربطها بمادة لاصقة جلدية.
- حقن 0.1 مل من 0.5٪ ماركائين في هوامش الجرح باستخدام إبرة معقمة 30 جم لمنع الألم الموضعي المرتبط بشق فروة الرأس.
- إعادة إلى السكن وتوفير المضادات الحيوية بعد الجراحة (0.48 ملغ/مل تريميثوبريم-سلفاميثوكسازول أو 0.5 ملغ/مل ليفوفلوكساسين) في مياه الشرب لمدة 5 أيام.
