الكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين في يرقات ذبابة الفاكهة باستخدام فحص ربط القرب

الملخص

المصدر: Wang, S., et al. الكشف عن في الموقع مجمعات البروتين في ذبابة الفاكهة الوصلة العصبية العضلية اليرقية باستخدام اختبار ربط التقارب. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو تصور تفاعلات البروتين والبروتين في ذبابة الفاكهة الوصلة العصبية العضلية (NMJ) باستخدام مقايسة ربط القرب (PLA). بعد عزل جدران الجسم ، يتم فحص البروتينات المتفاعلة مع الأجسام المضادة الأولية والأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع PLA. يسهل قرب البروتينات المتفاعلة ربط المجسات باستخدام قليل النوكليوتيدات الموصل ، وتشكيل الحمض النووي الدائري ، والذي يتم تضخيمه بعد ذلك عن طريق تضخيم الدائرة المتدحرجة. ترتبط مجسات الفلورسنت بالحمض النووي المضخم ، مما يسمح بتصور تفاعلات البروتين والبروتين في NMJ.

البروتوكول

p class = "jove_title" >1. إعداد جدار الجسم

ملاحظة: تم إجراء تحضير جدران جسم اليرقات في الطور الثالث (لدراسة NMJs التي تغذي عضلات جدار الجسم) كما هو موضح سابقا ولكن مع بعض التعديلات.

1. تشريح
   1. ارفع مخزون الذباب والتهجين عند 25 درجة مئوية لمدة خمسة إلى ستة أيام باستخدام الإجراءات القياسية.
   2. اختر يرقات الطور الثالث الزاحفة من القوارير أو الزجاجات باستخدام ملقط دقيق.
   3. اغسل اليرقات في طبق بتري صغير يحتوي على محلول ملحي للفوسفات (PBS) لإزالة أي جزيئات غذائية.
   4. ضع يرقة واحدة على قرص سيلجارد واغمرها في بضع قطرات من PBS المثلج. سيساعد استخدام PBS المثلج على صعق اليرقة مما يسهل التلاعب بها. طوال فترة التشريح ، تأكد من غمر المستحضر دائما في PBS لمنعه من الجفاف.
   5. ضع اليرقة بحيث يكون جانبها الظهري متجها لأعلى بحيث يكون المسالكان القصبيتان مرئيتين تحت مجهر تشريح (الشكل 1 أ). باستخدام الملقط للإمساك بدبوس صغير ، قم بتثبيت اليرقة لأسفل في الطرف الخلفي بالقرب من الفتحات التنفسية (الشكل 1 ب). باستخدام دبوس آخر ، اخترق البشرة في الطرف الأمامي بالقرب من خطافات الفم. قم بتمديد اليرقة برفق بالطول ، ثم قم بتثبيتها لأسفل (الشكل 1 ب).
   6. باستخدام مقص التشريح المجهري ، اضغط على الطرف الخلفي بالقرب من الدبوس لإنشاء فتحة صغيرة. يجب أن يكون الشق سطحيا بدرجة كافية ليمر عبر بشرة.
   7. ضع طرف الشفرة السفلية للمقص في الشق ، وقم بقصه بطول خط الوسط الظهري بالكامل بين المسالك القصبية (الشكل 1 ج). وجه شفرات المقص لأعلى قليلا عند القطع لتجنب إتلاف عضلات جدار الجسم البطني.
   8. قم بعمل شق أفقي صغير أمام الدبوس الخلفي قليلا (الشكل 1 ج). قم بعمل شق آخر مماثل خلف الدبوس الأمامي قليلا (الشكل 1 ج). يجب أن تمر الشقوق فقط عبر البشرة.
      ملاحظه: يجب أن تشبه الشقوق الثلاثة من الخطوتين 1.1.7 و 1.1.8 مجتمعة "" عند الانتهاء ، أي يجب إنتاج رفرف يسار ويمين على الجانب الظهري من جسم اليرقة.
   9. نظف الأعضاء الداخلية بعناية باستخدام الملقط. ستساعد إضافة بضع قطرات قوية من PBS على إزاحة الأعضاء من جسم اليرقات ، مما يسهل إزالتها. تجنب وخز جسم اليرقات لأنه سيسبب تلفا لعضلات جدار الجسم.
   10. افتح جسم اليرقات وقم بتثبيت الزوايا لأسفل (الشكل 1 د). عند التثبيت ، قم بتمديد جدار الجسم أفقيا وعموديا لتشكيل مستطيل مشدود بشكل متساو (انظر الشكل 1G للشكل) ، مع الحرص على عدم تمزق عضلات جدار الجسم في هذه العملية.
   11. الانتهاء من إزالة أي أعضاء داخلية متبقية (الشكل 1 ه).
2. التثبيت والنفاذية
   1. اغمر جدران الجسم المثبتة في عدة قطرات من محلول بوين. احتضن لمدة 15 دقيقة على الثلج. بدلا من ذلك ، استخدم 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) كمثبت بديل. احتضان لمدة 30 دقيقة.
   2. اشطف ثلاث مرات باستخدام محلول ملحي عازل للفوسفات مع تريتون (PBT).
   3. باستخدام ملقط دقيق ، قم بإزالة المسامير بعناية ونقل جدران الجسم من زواياها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.65 مل من السيليكون.
   4. قم بتخزين جدران الجسم في PBT عند 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة لجيش التحرير الشعبى الصينى. للحصول على أفضل النتائج ، ابدأ في تلطيخ جدران الجسم في غضون يوم أو يومين من التشريح.
      ملاحظه: لتوفير الكواشف ولضمان معالجة جميع جدران الجسم بالتساوي أثناء الفحص ، يمكن وضع أنماط وراثية مختلفة في أنبوب واحد. يمكن تمييز الأنماط الجينية عن طريق قطع زوايا جدران الجسم بشكل مختلف (انظر الشكل 1F على سبيل المثال).

< ص الفئة = "jove_title" >2. الكيمياء المناعية

ملاحظة: تم إجراء تلغيم مناعي لجدران جسم يرقات الطور الثالث كما هو موضح سابقا ولكن مع بعض التعديلات.
ملاحظه: قم بتنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة وبتحريض لطيف ما لم ينص على خلاف ذلك.

1. حظر
   1. اغسل جدران الجسم باستخدام PBT ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها.
   2. كتلة مع 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) لمدة 1 ساعة.
2. التلوين المناعي
   1. احتضان جدران الجسم بالأجسام المضادة الأولية للفأر والأرانب ضد البروتينين المعنيين (المخفف في 1٪ BSA) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. في هذه الحالة ، استخدم 1:10 ماوس مضاد ل Dlg (Dlg = أقراص كبيرة) و 1:250 أرنب مضاد ل HtsM (HtsM: Hu-li tai shao mutant). يمكن أيضا تضمين الأجسام المضادة ضد العلامات غير المصنوعة في الفأر أو الأرانب - على سبيل المثال ، استخدم 1: 200 ماعز مضاد ل Hrp (Hrp = بيروكسيداز الفجل) لتحديد الأغشية العصبية.
   2. يغسل باستخدام PBT ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما.
   3. احتضان الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور للكشف عن العلامات (المخففة في 1٪ BSA) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. نظرا لأن إشارة PLA يتم تصورها لاحقا باستخدام فلوروفور أحمر ، يجب استخدام فلوروفور آخر للكشف عن العلامة - على سبيل المثال ، استخدم 1: 200 Fluorescein isothiocyanate (FITC) مضاد للماعز للكشف عن الجسم المضاد للماعز المضاد ل Hrp. نظرا لاستخدام الكواشف الحساسة للضوء ، احتفظ بالأنابيب في الظلام من هذه النقطة فصاعدا.
      ملاحظه: تسمح المجموعة المستخدمة بإجراء PLA بين الأجسام المضادة الأولية التي يتم رفعها في الفأر والأرانب ، مع تصور الإشارة على القناة الحمراء تحت الفحص المجهري متحد البؤر. إذا رغبت في ذلك ، تتوفر مجموعات أخرى تسمح بإجراء الفحص باستخدام الأجسام المضادة الأولية التي يتم رفعها في الأنواع الأخرى ، والإشارة المتصورة على قنوات أخرى.

< p class = "jove_title" >3. فحص ربط القرب

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة وبتحريض لطيف ما لم ينص على خلاف ذلك.

1. مجسات جيش التحرير الشعبى الصينى
   1. اغسل جدران الجسم باستخدام PBT ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها.
   2. احتضان مع مجسات PLA (تخفيف 1: 5 لكل منها 1٪ BSA) لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. في هذه الحالة ، استخدم 40 ميكرولتر من مسبار جيش التحرير الشعبى الصينى المضاد للفأر ناقص ، و 40 ميكرولتر من مسبار جيش التحرير الشعبى الصينى المضاد للأرانب PLUS و 120 ميكرولتر من 1٪ BSA لضمان الغمر والخلط المناسبين لجدران الجسم 5-10. يمكن أن يؤدي التخفيف حتى 1:25 من مجسات PLA إلى نسبة إشارة إلى ضوضاء كافية (أي لهذه التجربة).
2. الربط
   1. اغسل جدران الجسم باستخدام Wash Buffer A مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
   2. احتضان بمحلول الربط (تخفيف 1:40 من Ligase في المخزن المؤقت للربط) لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. في هذه الحالة ، استخدم 5 ميكرولتر من Ligase و 40 ميكرولتر من 5 Bindation buffer و 155 ميكرولتر من الماء عالي النقاء لضمان الغمر والخلط المناسبين لجدران الجسم 5-10.
3. التضخيم
   1. اغسل جدران الجسم باستخدام Wash Buffer A مرتين لمدة دقيقتين لكل منهما.
   2. احتضان بمحلول التضخيم (تخفيف 1:80 من البوليميراز في المخزن المؤقت للتضخيم) لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. في هذه الحالة ، استخدم 2.5 ميكرولتر من البوليميراز ، و 40 ميكرولتر من 5 عازلة تضخيم و 157.5 ميكرولتر من الماء عالي النقاء لضمان الغمر والخلط المناسبين لجدران الجسم 5-10.
4. التحضير للتصوير
   1. اغسل جدران الجسم باستخدام Wash Buffer B مرتين لمدة 10 دقائق لكل منهما.
   2. يغسل ب 0.01x Wash Buffer B مرة واحدة لمدة 1 دقيقة.
   3. قم بالتوازن في بضع قطرات من محلول التركيب لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التركيب ، أو قم بتخزينه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   4. باستخدام ملقط دقيق ، انقل جدران الجسم بعناية إلى شريحة منصة بحيث تكون بشرتها متجهة لأسفل. ضع جدران الجسم في صفوف وفي نفس الاتجاه داخل قطرة أو اثنتين من الحامل. ضع غطاء مقاس 22 مم × 40 مم فوق المستحضر مع الحرص على عدم إنتاج فقاعات هواء ، ثم أغلق الشريحة بطلاء أظافر شفاف.
   5. قم بتخزين الشرائح في الظلام عند -20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للتصوير متحد البؤر.

النتائج

الشكل 1: تحضير جدران جسم اليرقات في الطور الثالث. (أ-و) رسومات تخطيطية تمثل تشريح جدار الجسم. (أ) ضع يرقة واحدة على قرص سيلغارد بحيث يكون جانبها الظهري متجها لأعلى بحيث يكون المسالك القصبية مرئية. (B) قم بتثبيت اليرقة لأسفل في النهايات الأمامية والخلفية بدبابيس دقيقة، مد اليرقة بالطول في هذه العملية. (C) قم بعمل ثلاثة شقوق في الجانب الظهري من جسم...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ملقط (غرامة # 5)	الطبيب	أ10-704
قرص سيلجارد	الأجهزة الدقيقة العالمية	SYLG184	امزج قاعدة المطاط الصناعي وعامل المعالجة بنسبة 10: 1. اضبط لمدة 30 دقيقة. تصب في قالب (على سبيل المثال ، استخدم لوحة زراعة الخلايا المكونة من 12 بئرا). اتركه يشفى لمدة 24 ساعة على الأقل. التمسك بغطاء غطاء طبق بتري مقاس 60 × 15 مم عند التشريح.
دبابيس Minutien (قطر طرف 0.0125 مم)	أدوات العلوم الجميلة	26002-10
مقص التشريح المجهري (فائق النعومة)	أدوات العلوم الجميلة	15200-00
شرائح النظام الأساسي			قم بلصق غطاءين مقاس 22 × 22 مم على شريحة مجهرية مع طلاء أظافر شفاف ، مع ترك فجوة <20 مم بينهما لتركيب العينة.
w1118	مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة	3605
HTS01103	مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة للمخزون	10989	تمت إعادة موازنة المخزون عبر موازن GFP بحيث يمكن اختيار الطفرات متماثلة اللواقح بناء على عدم وجود إشارة GFP.
1x PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات): 3 ملي NaH2PO4 ، 7 ملي مولار Na2HPO4 ، 130 ملي كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.0			NaH2PO4 (مختبرات كاليدون - 8180-1) ، Na2HPO4 (كاليدون - 8120-1) ، كلوريد الصوديوم (كاليدون - 7560-1)
حل بوين	سيجما ألدريتش	HT10132
4٪ PFA (بارافورمالدهايد): 4٪ PFA في 1x PBS			PFA (علم الحساسية - 66194-300). انظر doi: 10.1101 / pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 للحصول على إرشادات حول كيفية صنع الحل.
1x PBT (محلول ملحي مخزن بالفوسفات مع تريتون): 1x PBS مع 0.01٪ تريتون			تريتون X-100 (سيجما ألدريتش - T8787)
1٪ BSA (ألبومين مصل الأبقار): 1٪ BSA في 1x PBT			BSA (Bioshop Canada - ALB001). يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية
الماوس المضاد ل Dlg (الأقراص الكبيرة)	دراسات التنمية بنك الورم الهجين	4F3	استخدم عند تخفيف 1:10 في 1٪ BSA.
أرنب مضاد ل HtsM (Hu-li tai shao)			مقدمة من الدكتورة لين كولي (جامعة ييل). استخدم عند تخفيف 1: 250 في 1٪ BSA.
أرنب مضاد لباك (كيناز منشط p21)			مقدمة من الدكتور نيكولاس هاردن (جامعة سيمون فريزر). استخدم عند تخفيف 1: 500 في 1٪ BSA.
الفأر المضاد ل Wg (بلا جناحات)	دراسات التنمية بنك الورم الهجين	4D4	يستخدم عند تخفيف 1: 5 في 1٪ BSA.
الماعز المضاد للهروب (بيروكسيداز الفجل)	جاكسون للأبحاث المناعية	123-065-021	استخدم عند تخفيف 1: 200 في 1٪ BSA.
حمار مترافق FITC مضاد للماعز	جاكسون للأبحاث المناعية	705-095-003	استخدم عند تخفيف 1: 200 في 1٪ BSA.
Duolink في الموقع مسبار جيش التحرير الشعبى الصينى المضاد للفأر ناقص	سيجما ألدريتش	DUO92004
Duolink في الموقع مسبار جيش التحرير الشعبى الصينى المضاد للأرانب PLUS	سيجما ألدريتش	DUO92002
كواشف الكشف عن Duolink في الموقع الأحمر	سيجما ألدريتش	DUO92008
1x عازلة غسيل A: 0.01M Tris ، 0.15M كلوريد الصوديوم ، 0.05٪ توين 20 ، درجة الحموضة 7.4	سيجما ألدريتش	DUO82049	تريس (مختبرات كاليدون - 8980-1) ، كلوريد الصوديوم (كاليدون - 7560-1) ، توين 20 (فيشر ساينتفيك - BP337)
1x عازلة الغسيل B: 0.2 مليون تروس ، 0.1 مليون كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.5	سيجما ألدريتش	DUO82049	تريس (مختبرات كاليدون - 8980-1) ، كلوريد الصوديوم (كاليدون - 7560-1)
0.01x عازلة الغسيل B: 2 ملي تريس ، 1 ملم كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.5	سيجما ألدريتش	DUO82049	تريس (مختبرات كاليدون - 8980-1) ، كلوريد الصوديوم (كاليدون - 7560-1)
Duolink في الموقع تركيب وسيط مع DAPI	سيجما ألدريتش	DUO82040