مقالة منهجية

تحديد قدرة الميتوكوندريا المعزولة على الاحتفاظ بالكالسيوم

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Li, W., et. al. مقايسة قدرة الاحتفاظ بالميتوكوندريا Ca2+ ومقايسة تورم الميتوكوندريا الناجم عن Ca2+. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو إجراء تقييم قدرة احتباس الكالسيوم في الميتوكوندريا من خلال مراقبة التغيرات في الوقت الفعلي في التألق مع امتصاص الميتوكوندريا للكالسيوم. هذا الاختبار مفيد لدراسة وظيفة الميتوكوندريا والعمليات المتعلقة بالكالسيوم ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج والأمراض التنكسية العصبية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تحديد قدرة الاحتفاظ بالميتوكوندريا Ca2+

  1. تحضير وسائط KCl (125 ملي مولار KCl (كلوريد البوتاسيوم) ، 2 ملي مولار K2HPO4 (فوسفات ثنائي البوتاسيوم) ، 1 ملي مولار MgCl2 (كلوريد المغنيسيوم) ، 20 ملي مولار HEPES (2- [4- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين -1-yl] حمض الإيثانسلفونيك) ، 5 ملي مولار غلوتامات ، 5 ملي مولار مالات ، و 2 ميكرومتر روتينون ، درجة الحموضة 7.4) وأضف صبغة الفلورسنت الخضراء الملزمة Ca2 + إلى تركيز نهائي يبلغ 0.5 ميكرومتر قبل التجربة.
  2. انقل 1 مل من الميتوكوندريا المعزولة (0.4 مجم / مل) في وسائط KCl التي تحتوي على 0.5 ميكرومتر من الكالسيوم 2+ صبغة فلورية خضراء ملزمة إلى كل بئر من 6 آبار.
  3. احتضان الميتوكوندريا وصبغة الفلورسنت الخضراء الملزمة ب Ca2 + في صفيحة 6 آبار في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء المحيط لمدة 1 دقيقة. أضف 4 ميكرولتر من محلول 20 ملي كاستلامالكالسيوم 2 (كلوريد الكالسيوم) (20 ملي مولار كلوريدالكالسيوم 2 ، 127 ملي كلوريد الكالسيوم ، 1 ملي ملي كلوريد2 ، 20 ملي هيبس ، 5 ملي غلوتامات ، 5 ملي مولار مالات ، درجة الحموضة 7.4) لكل بئر من 6 آبار باستخدام إعداد التوزيع التلقائي لإدخال 200 نانومول من الكالسيوم2 + / مجم بروتين الميتوكوندريا.
  4. استخدم مطياف التألق لمراقبة التغيرات الفلورية كل 3 ثوان لمدة دقيقتين بطول موجي للإثارة يبلغ 506 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 531 نانومتر. تم تجهيز اللوحة بالاهتزاز عند 600 دورة في الدقيقة لمدة 3 ثوان بين القراءات التي يتم التحكم فيها بواسطة البرنامج (الشكل 1).
  5. أضف 4 ميكرولتر إضافيا من محلول 20 ملي CaCl2 لكل بئر وراقب تغيرات التألق كل 3 ثوان لمدة دقيقتين. كرر هذه الخطوة حتى يزداد التألق بمرور الوقت.
    ملاحظه: يتم تحدي الميتوكوندريا مع إضافة Ca2+ المشار إليها من خلال زيادة تألق التسجيل. عندما يفتح mPTP (مسام انتقال نفاذية الميتوكوندريا) ، يزداد التألق بمرور الوقت.
  6. قم بتفسير المبلغ الإجمالي ل Ca2+ المضاف حتى يفتح mPTP كسعة الاحتفاظ Ca2+.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1: إعدادات البرامج لمقايسة قدرة الاستبقاء في الميتوكوندريا Ca2+ مقايسة قدرة الاستبقاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أخضر الكالسيوم -5N تقنيات الحياة C-3737 صبغة الفلورسنت الخضراء ملزمة للكالسيوم
الغلوتامات سيجما ألدريتش RES5063G-A7
مالاتسيجما ألدريتش 46940-U
روتينونيسيجما ألدريتش R8875
HEPESسيجما ألدريتش H3375
كلوريد المغنيسيوم سيجما ألدريتش 457
فوسفات ثنائي البوتاسيومسيجما ألدريتش V900050
KClسيجما ألدريتش P9541
كلوريد الكالسيومسيجما ألدريتش V900266

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة