$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. تحضير أنظمة ضخ المضخة التناضحية الدقيقة
ملاحظة: قم بإعداد المضخة ، ومحلول السائل النخاعي الاصطناعي (aCSF) ، والدواء (محلول بروتين Met-CCL5 / RANTES (10 نانوغرام / مل في aCSF)) في ظروف معقمة باستخدام مخازن مؤقتة تمت ترشيحها بمرشحات 0.2 ميكرومتر وقم بإجراء جميع الإجراءات تحت غطاء المزرعة بالقفازات. تتم إجراءات الجراحة على النحو التالي:
- تحضير المضخات التناضحية الدقيقة قبل يوم واحد من الجراحة: املأ مضخة التناضح الدقيق للدماغ بالسائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF) بحقنة سعة 1 مل وإبرة رأس حادة مع المجموعة. اغمر المضخة التناضحية الدقيقة في aCSF وضعها على شاكر مع رج لطيف طوال الليل><.
تنبيه: يجب ملء المضخة ب aCSF ، ويجب تجنب فقاعات الهواء داخل المضخة (الشكل 1 أ).
- قبل بدء الجراحة ، قم بإعداد محلول البروتين المؤتلف Met-CCL5 / RANTES (10 نانوغرام / مل ، مخفف في aCSF) للتجربة. قم بإزالة aCSF من المضخة واملأ المضخة بمحلول الدواء ببطء حتى يتسرب الزائد.
ملاحظة: محلول 15 مل aCSF أو Met-CCL5 / RANTES يكفي ل 5-8 مضخات.
تنبيه: كرر الإجراء للتأكد من أن المضخة ممتلئة بالكامل بالدواء بدون فقاعات بداخلها.
- قم بقص أنابيب القسطرة بالطول المطلوب وقم بتوصيلها بإبرة تسريب الدماغ الحادة في مجموعة تسريب الدماغ. املأ مجموعة التسريب والأنابيب بالدواء.
- أخيرا ، قم بتجميع مجموعة ضخ الدماغ وإرفاقها بالمضخة التناضحية الدقيقة.
تنبيه: يجب عدم تكوين فقاعات في الأنبوب أو المضخة (الشكل 1 أ).
- اغمر مجموعة اندماج المضخة التناضحية بالكامل في aCSF في أنبوب معقم سعة 50 مل لمنع المضخة من الجفاف. مجموعة اندماج المضخة التناضحية والدماغ جاهزة الآن للاستخدام في الجراحة.
ملاحظة: يمكن استخدام أنظمة المضخات التناضحية الدقيقة لضخ الأدوية على المدى الطويل. هذا يضمن وضعا آمنا ومريحا لتوصيل المخدرات إلى دماغ الفأر.
< p class = "jove_title" >
2. جراحة البطين داخل المخ - زرع المضخة التناضحية الدقيقة
CAUTION: قم بتعقيم البيئة الجراحية بنسبة 75٪ من الإيثانول وتأكد من أن الأشخاص المشاركين في الدراسة يرتدون قفازات معقمة ومعطف مختبر نظيف. يجب تعقيم الأدوات / الأدوات الجراحية وتجفيفها قبل الاستخدام ثم تعقيمها بنسبة 75٪ من الإيثانول بين جراحات الفئران.
- قم بوزن الفأر وتخديره باستخدام الحقن داخل الصفاق (IP) مع الكيتامين / الزيلازين (الكيتامين 50 مجم / كجم ، الزيلازين 10 مجم / كجم).
تنبيه: لا ينصح باستخدام أوزان جسم الفئران التي تقل عن 24 جراما لجراحة زرع المضخة التناضحية.
- قم بتركيب رأس الماوس وتثبيته على الجهاز التجسيمي (الشكل 1 ب).
- استخدم زوجا من المقصات والكماشة الجراحية لفتح الجلد الخارجي الذي يغطي الجمجمة. استخدم اليود لتنظيف الجمجمة الطرفية.
- افصل الطبقة الخارجية من الجلد عن الجلد تحت الجلد بمساعدة زوج من الكماشة ذات الرأس الحاد بالقرب من منطقة الرقبة لزرع مجموعة اندماج المضخة التناضحية والدماغ (الشكل 1 ج).
- ضع علامة على نقطة التسريب بالإشارة إلى خريطة الدماغ (الشكل 1D) باستخدام الجهاز التجسيمي. في هذه التجربة ، يجب زرع الإبرة في منطقة البطين 3 (Bregma: 0.0 مم جانبي ، 1.3 مم خلفي ، 5.7 مم بطني).
- احفر حفرة باستخدام مثقاب الأظافر حول المنطقة المميزة على الجمجمة (الشكل 1E).
تنبيه: احرص على عدم كسر السحايا والأوعية الدموية للفأر ، وبالتالي تجنب تعطيل الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ.
- ضع مجموعة اندماج الدماغ ذات المضخة التناضحية الدقيقة التي تحتوي على aCSF (كعنصر تحكم) أو دواء (محلول بروتين Met-CCL5 / RANTES) تحت الجلد خلف منطقة الرقبة وأدخل إبرة تسريب الدماغ في الفتحة المحفورة لضخ الدواء في دماغ الفأر (الشكل 1E). سوف تخترق الإبرة السحايا وتدخل البطين. ثبت الإبرة في مكانها على الجمجمة باستخدام جل مزيل للحساسية السطحية (الشكل 1F) وانتظر 1-2 دقيقة حتى يجف الغراء. بعد ذلك ، قم بقطع الجزء البارز أعلى الإبرة (الشكل 1G-H).
- استخدم غراء لاصق للأنسجة لشفاء جرح العملية على الرأس. ضع 50 ميكرولتر من الغراء فوق الجرح ، واسحب جانبي الجلد معا ، واستمر لمدة 30 ثانية للسماح للجلد بالإغلاق (الشكل 1I).
تنبيه: استخدم ضمادة كحولية بنسبة 100٪ لتنظيف الجرح بعد الجراحة و 100 أولتر بنسلين مع الستربتومايسين لمنع العدوى. ملاحظه: سيشكل جلد الفأر نسيجا ندبيا ويلتئم في غضون أيام قليلة بعد إعطاء الغراء الجراحي. الميزة الرئيسية للغراء هي تجنب الغرز الجراحية ، والتي قد تسبب تهيج الجلد أو التهابه.
- ضع الماوس في قفص نظيف محفوظ على طبق دافئ (يسخن حتى 37 درجة مئوية) وانتظر حتى يتعافى الماوس من تأثير التخدير.
تنبيه: من الأهمية بمكان الحفاظ على درجة حرارة جسم الفأر لتعزيز فرصة البقاء على قيد الحياة بعد الجراحة.
- بعد فترة نقاهة مدتها أسبوع واحد ، ستكون الفئران جاهزة لمزيد من التجارب ، مثل اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم (OGTT) واختبار تحمل الأنسولين (ITT).
فئة
3. اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم (OGTT)
< p class = "jove_content" >
ملاحظة: قم بإجراء اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم بعد 7 أيام من تسريب aCSF و
MetCCL5 / RANTES (10 نانوغرام / مل ، 100 ميكرولتر). حافظ على صيام 6 ساعات للفئران قبل OGTT مع إمدادات المياه الكافية. احتفظ بالحيوانات على نفس منضدة العمل حيث سيتم إجراء التجارب حتى تتمكن من التأقلم مع البيئة لتقليل التوتر أثناء العملية.
- تحضير محلول الجلوكوز: قبل إجراء التجربة ، قم بإعداد محلول الجلوكوز عن طريق إذابة 3.75 جم من الجلوكوز في 15 مل من H2O المقطر.
- قم بإعداد جدول زمني لتسجيل القراءات أثناء الإجراء التجريبي (الجدول 1).
ملاحظة: من المهم إعداد جدول زمني بفترات زمنية مناسبة بين كل فحص دم للسماح بالتسجيل الدقيق أثناء التجربة.
- قم بوزن كل فأر بعد الصيام واحسب الكمية المناسبة من الجلوكوز المراد حقنها. على سبيل المثال ، إذا كان وزن الفأر 30 جراما ، فيجب أن تكون كمية محلول الجلوكوز المراد إعطاؤها 300 ميكرولتر.
- قم بإعداد الأدوات التالية على طاولة العمل:
- مقياس السكر (اضغط على زر البدء للتحقق من حالة البطارية ؛ تأكد من أنها تعمل قبل الاختبار.)
- رقاقة الجلوكوز
- حقنة الأنسولين (0.3 مل حقنة الأنسولين)
- شفرات الحلاقه
- الموقت
- بمجرد إعداد المقعد ، قم بقياس وتسجيل مستوى الجلوكوز في الدم على النحو التالي: ضع شريحة جلوكوز نظيفة وجديدة في جهاز قياس السكر واضغط على زر البدء لصفيرها.
- التقط الفأر من مؤخرة العنق وقم بضرب الذيل عدة مرات لضمان تدفق الدم الكافي إلى منطقة الذيل.
- استخدام شفرة حلاقة جديدة لقطع قطعة صغيرة من الذيل والضغط على قطرة صغيرة من الدم (حوالي 10-20 ميكرولتر) في شريحة الجلوكوز. يجب أن يملأ الدم الرقاقة للسماح بالقياس الدقيق. سيعرض جهاز قياس السكر مستوى الجلوكوز على الفور. إذا أظهر الجهاز "خطأ" ، فكرر الإجراء باستخدام شريحة جلوكوز جديدة.
ملاحظة: تتطلب شريحة الجلوكوز قطرة دم واحدة فقط. عندما تحتاج عينة الدم إلى الجمع أكثر من مرة ، ما عليك سوى الضغط عن طريق تمرير أصابعك على طول ذيل الفأر عدة مرات مع إمساك نهاية الذيل مباشرة فوق الرقاقة لجمع الدم. ليس من الضروري قطع نهاية الذيل في كل مرة أثناء جمع عينات الدم.
- بعد ذلك ، قم بإطعام الفئران الجلوكوز (0.25 جم / مل) عن طريق الفم باستخدام تقنية التزقيم داخل المعدة. يجب حساب كمية الجلوكوز المراد إعطاؤها باستخدام الصيغة: 10X وزن الجسم (BW) محلول الجلوكوز 10X (على سبيل المثال ، إذا كان وزن الفأر 30 جراما ، فإن كمية محلول الجلوكوز التي سيتم إعطاؤها ستكون 300 ميكرولتر). ابدأ المؤقت مباشرة بعد إعطاء الجلوكوز عن طريق الفم.
- كرر إجراء قياس الجلوكوز في 15 و 30 و 60 و 90 و 120 دقيقة.
- بعد تسجيل جميع قراءات مستوى الجلوكوز ، تخلص من شفرات الحلاقة ورقائق الجلوكوز في حاوية بيولوجية. ضع الطعام مرة أخرى في أقفاص الفئران وأعده إلى غرفة.
< p class = "jove_content" >
الجدول 1. الجدول الزمني لتسجيل اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم (OGTT)
#
معرف الماوس
جسم
الجلوكوز
بدء
0
15
30
60
90
ثقل
ميكرولتر = 10 × BW
الوقت
دقيقه
دقيقه
دقيقه
دقيقه
دقيقه
1
501 ريال
25.8 جرام
258
9:00
9:00
9:00
9:15
9:30
10:00
2
502 ريال
25.3 جرام
253
9:07
9:07
9:07
9:22
9:37
10:07
