$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية للحيوان المناسبة.
1. تحضير الشرائح والأنسجة
- استخدم إما شرائح سيلان الإعدادية أو شرائح زجاجية غشائية من البولي إيثيلين نبثالات (PEN).
- لعزل الحمض النووي الريبي ، اغمس الشرائح في محلول إزالة التلوث RNase ، واغسلها 3 مرات بالماء الخالي من RNase ثم جففها بسلسلة متدرجة من الإيثانول الخالي من RNase وجففها بالمكنسة الكهربائية لمدة 30 دقيقة.
- قم بقص أقسام الأنسجة بسمك 10 ميكرومتر باستخدام ناظم البرد وقم بتثبيتها على الشرائح الخالية من RNase المحضرة. احتفظ بالأقسام المجمدة أثناء التقسيم للحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي. ملاحظه: تأكد من أن الأنسجة تبعد حوالي 4 مم عن حواف الشريحة حيث لا يمكن ل LCM إزالة الأنسجة القريبة جدا من حواف الشريحة. من أجل إزالة الأنسجة من شريحة غشاء PEN ، تأكد من أن الأنسجة على بعد 4 مم من اليسار والأعلى والأسفل و 7 مم من الجانب الأيمن من الشريحة وهي أبعاد الغشاء غير المتصل بالشريحة.
- لعزل مجموعات الخلايا الفردية باستخدام الكيمياء المناعية المباشرة ، قم بتقسيم الأنسجة إما على شرائح Silane-prep أو شرائح غشاء PEN. لعزل مناطق الأنسجة باستخدام التقنيات الموجهة للكيمياء المناعية غير المباشرة ، قم بتركيب مجموعة واحدة من الأقسام على شريحة Silane-prep للكيمياء المناعية والأقسام البديلة إما على شريحة غشاء PEN و / أو شريحة Silane-prep لاستخدامها في LCM.
2. تحضير الأنسجة لالتقاط الليزر - الكيمياء المناعية السريعة لهيدروكسيلاز التيروزين للالتقاط المباشر بالليزر للخلايا المناعية حدد
- الأنسجة بقلم كاره للماء واتركه حتى يجف.
- قم بإصلاح الأنسجة في محلول الأسيتون والميثانول (1: 1) عند -20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ملاحظة: أظهرت تجربتنا أن تثبيت الأسيتون والميثانول أدى إلى كيمياء مناعية أكثر اتساقا من الأسيتون أو الميثانول وحده.
- اشطف الشريحة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بنسبة 1٪ تريتون (خال من RNase).
- قم بتغطية الأقسام ب 100-200 ميكرولتر PBS مع 1٪ تريتون مع الجسم المضاد للتيروزين هيدروكسيلاز المخفف 1: 100 مع 400 وحدة / مل RNasin. احتضن لمدة 5-10 دقائق.
- اشطفها لفترة وجيزة في PBS مرتين و PBS-1٪ Triton.
- قم بتغطية المناديل الورقية ب 100-200 ميكرولتر من IgG المضاد للأرانب الماعز المسمى ب Alexa Fluor 488 المخفف 1: 100 في PBS-1٪ Triton مع 400 U / ml RNasin و 50 نانوغرام / مل DAPI. احتضن لمدة 5 دقائق.
- اشطف مرتين في PBS ثم جفف 30 ثانية في سلسلة متدرجة من الإيثانول الخالي من RNase (75٪ -75٪ -95٪ -95٪ -100٪ -100٪).
- احتضن في غسلتين من الزيلين لمدة 1 دقيقة ثم 5 دقائق.
- قم بإزالة الشرائح من الزيلين مباشرة قبل استخدامها للغصال المضاعف المشترك الأصغر واتركها حتى تجف في الهواء.