دراسة تهريب البروتين الغشائي في ذبابة الفاكهة الخلايا المستقبلة للضوء

الملخص

المصدر: Wagner، K. et al.، دراسة تهريب البروتين الغشائي في ذبابة الفاكهة الخلايا المستقبلة للضوء باستخدام البروتينات التي تحمل علامة eGFP. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح هذا الفيديو تصور تهريب البروتين الغشائي في ذبابة الفاكهة الخلايا المستقبلة للضوء باستخدام بروتينات TRPL الموسومة ب eGFP. يفصل تحضير الذباب المعدل وراثيا للتصوير ، والتقاط صور مضان للخلايا المستقبلة للضوء ، والتقدير الكمي لتهريب TRPL عن طريق قياس مضان eGFP النسبي في المخططات.

البروتوكول

1. اعتبارات عامة

1. استخدم ذبابة الفاكهة التي تعبر عن بروتينات انتقال موجودة بشكل دائم لإجراء تحليلات تتعلق بالاتجار بالبروتين (على سبيل المثال ، القناة الأيونية الشبيهة بإمكانات المستقبلات العابرة (TRPL):: بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن (eGFP) ، Arrestin 2 (Arr2) :: eGFP).
2. تحديد ظروف التعرض للضوء مسبقا للذباب المختار للنهج التجريبي.
   1. للتكيف مع الظلام ، احتفظ بالذباب في صناديق مظلمة للفترة المطلوبة عند 25 درجة مئوية. للإضاءة حتى 16 ساعة في تجارب الإزاحة (على سبيل المثال ، TRPL:: eGFP التي تعبر عن الذباب) ، احتفظ بالذباب تحت أنبوب فلورسنت في درجة حرارة الغرفة.
   2. لإضاءة الذباب بالضوء الملون ، استخدم صناديق بلاستيكية شفافة ملونة مختلفة جنبا إلى جنب مع أنبوب الفلورسنت.

2. الفحص المجهري بالغمر في الماء

1. إعداد الذباب
   1. تجهيز مساحة العمل بالمعدات والكواشف اللازمة، كما هو موضح في الشكل 1. انقل الذباب بظروف العمر والإضاءة المحددة مسبقا إلى أنبوب طرد مركزي مبرد مسبقا سعة 15 مل وقم بالتخدير عن طريق احتضانه على الجليد لمدة 15 إلى 30 دقيقة.
      } ملاحظة: احمل الذباب البالغ من العمر يوم واحد والمتكيف مع الظلام كمرجع. بشكل عام ، يجب نقل الذباب المتكيف مع الظلام إلى صندوق ثلج بغطاء في الظلام. يمكن نقل الذباب المتكيف مع الضوء إلى الجليد في ضوء الغرفة.
   2. انقل ذبابة واحدة مخدرة بالثلج رأسا على عقب إلى طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر وادفع الذبابة نحو الحافة بعناية باستخدام الهواء المضغوط.
   3. اقطع طرف الماصة أمام الرأس مباشرة باستخدام مشرط. باستخدام الملقط ، ادفع الذبابة بعناية على بعد بضعة ملليمترات من الحافة. اقطع طرف الماصة مرة أخرى وادفع الذبابة للخلف باتجاه الطرف بالهواء المضغوط بحيث يبرز رأس الذبابة فقط من طرف الماصة.
   4. ألصق قطعة من البلاستيسين على شريحة جسم واضغط على طرف الماصة بداخلها بحيث تتجه العين اليسرى أو اليمنى للذبابة لأعلى ( الشكل 2 أ ). قبل الحصول على الصورة مباشرة، استخدم ماصة معملية للصق قطرة كبيرة من الماء المبرد على الجانب السفلي من هدف الغمر في الماء ( الشكل 2 ب ). انتقل على الفور إلى الحصول على الصور للحصول على أفضل النتائج.
      ملاحظة: يؤدي التأخير الكبير في الحصول على الصور إلى إيقاظ الذبابة وحركات الذبابة مما قد يؤدي إلى صور ضبابية.
      
2. الحصول على الصور
   1. ضع الكائن بعناية مع الذبابة المعدة على مرحلة المجهر وحدد هدف الغمر في الماء.
   2. اخفض هدف الغمر في الماء يدويا حتى تلمس عين الذبابة القطرة ( الشكل 3 أ ، ب ).
   3. قم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية المجهر وحدد مجموعة المرشحات المناسبة. استخدم العدسات لوضع الذبابة تحت الهدف وتركيز المجهر على سطح العين.
   4. قم بتبديل مسار الضوء باتجاه كاميرا المجهر وقم بإنشاء صورة حية في البرنامج المقابل. أعد ضبط التركيز البؤري للكاميرا وقم بتقييم اتجاه العين ، مع الأخذ في الاعتبار أن العين يجب أن تواجه هدف المجهر شعاعيا ، كما هو موضح بمزيد من التفصيل في الشكل 3C-E .
   5. استخدم جدول البحث (جدول البحث) المناسب داخل برنامج التصوير لاكتشاف التشبع الزائد (يشار إليه بوحدات البكسل الحمراء).
   6. في حالة الذباب غير المصطبغ، اضبط وقت التعرض بحيث تكون وحدات البكسل الأكثر سطوعا أقل بقليل من حد التشبع لكل صورة.
   7. سجل صورة واحفظها كملف خام لأرشفة جميع البيانات الوصفية المقابلة للتسجيل. قم بتصدير الصورة بتنسيق .tif للقياس الكمي التالي.
      ملاحظة: قم بإضاءة الذباب لمدة 5 دقائق بالضوء الأحمر (على سبيل المثال ، 630 نانومتر) مباشرة بعد الحصول على الصورة ، إذا كان من المفترض استخدامها في مزيد من التجارب. يقوم الضوء الأحمر بإلغاء تنشيط سلسلة النقل الضوئي التي تم تنشيطها بشكل مفرط بواسطة الضوء الشديد قصير الموجة أثناء الحصول على الصورة.
      
3. تحليل البيانات والقياس الكمي لمضان eGFP النسبي في مخططات الصور المجهرية بالغمر في الماء
   1. تنزيل البرنامج ImageJ/Fiji وتثبيته وتنفيذه.
   2. اضبط إعدادات ImageJ بالنقر فوق تحليل > تعيين القياسات ... وحدد فقط المربع الخاص ب متوسط القيمة الرمادية. قم باستيراد صورة .tif بالنقر فوق ملف > فتح... أو عن طريق السحب والإفلات. اختر منطقة تمثيلية للصورة قيد التركيز وقم بتكبيرها إلى 200٪ -300٪ بالضغط بشكل متكرر على Ctrl و + معا.
   3. حدد الأداة البيضاوية ، وأثناء الضغط على المفتاح Shift ، قم بإنشاء تحديد دائري في الصورة أصغر بكثير من رابدومير فلوري واحد. قبل تحرير زر الماوس ، ابحث عن الحجم الدقيق المعروض أسفل شريط الأدوات في نافذة ImageJ الرئيسية. استخدم نفس حجم التحديد الدائري لجميع التحليلات.
      ملاحظة: يعتمد الحجم الدقيق للتحديد الدائري بالبكسل أو الميكرون على الإعداد المحدد. استخدم دائرة حوالي 1/3 أو 1/4 من القطر الربيدي لذباب التحكم البالغ من العمر يوم واحد والمتكيف مع الظلام.
   4. حرك التحديد الدائري إما عن طريق النقر بالماوس فيه والسحب أو بالضغط على مفاتيح الأسهم على لوحة المفاتيح.
   5. لقياس شدة التألق داخل التحديد الدائري ، انقل الدائرة إلى الربدوم الأول (r1) وانقر على تحليل > قياس أو استخدم الاختصار Ctrl + M . ستظهر نافذة { النتيجة التي تسرد القيمة الرمادية المقاسة.
   6. استمر في قياسات r2-r6 كقياسات متكررة وقياس إشارة الخلفية (ب). في حالة الذباب غير المصطبغ ، قم بإجراء قياسات إضافية لمناطق جسم الخلية المقابلة (c1-c6) ( الشكل 4 ).
   7. كرر الخطوتين 2.3.5 و 2.3.6 لاثنين آخرين من ommatidia ، مما ينتج عنه ثلاث تكرارات تقنية. ضع علامة على ommatidia التي تم تحليلها باستخدام أداة Pencil واحفظ هذه الصورة للوثائق.
   8. حدد القيم الرمادية المقاسة وانسخها من نافذة النتيجة والصقها في برنامج جداول البيانات لمزيد من العمليات الحسابية. قم بفرز قيم شدة التألق وفقا لأصلها في فئات rhabdomere (r) وجسم الخلية (c) والخلفية (b). احسب متوسط الشدة من كل فئة (Ir، Ic، Ib).
   9. احسب الكمية النسبية ل eGFP الموجودة في الربدومير.
   10. تابع الصورة التالية في الخطوة 2.3.3. يوصى باستخدام صور من خمسة أفراد على الأقل من كل مجموعة تجريبية كتكرارات بيولوجية للحصول على قياس موثوق.

النتائج

فئة الشكل = 'صورة image-style-align-center image_resized' style = 'display: table ؛ margin-left: auto ؛ margin-right: auto ؛ width: 75٪ ؛ '>

الشكل 1: مساحة عمل الفحص المجهري بالغمر في الماء. المواد المطلوبة هي: (أ) أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، (ب) رقائق ثلج ، (ج) الماء المقطر المبرد ، (د) المجهر الم...

المواد

<فئة الشكل = نمط الجدول: "العرض: 969pt ؛'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 15 mL أنبوب الطرد المركزيGreiner Bio-One188271Flystuff59-172 مصباح الضوء البارد (KL 1500 LCD)Zeiss Fiji/ImageJNIH Fluorscope مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية والكاميرا ومجموعة المرشحات والبرامج (AxioImager.Z1m ، Axiocam 530 mono ، 38 HE ، ZEN2 blue edition) < td style = 'border-left-style: none ؛ border-top-style: none ؛ '>Zeiss < td style = 'border-left-style: none ؛ border-top-style: none ؛ '> Fluorescent tube Osram4050300518039.00 ماصة مختبرية (20-200 ميكرولتر)Eppendorf Object slideRoth656.1 tipates pipette (200 μL)Labsolute7695844 Plasticine (Blu-Tack)Bostik30811745 مجهر ستيريو (SMZ445)Nikon Stereoscope with light uv lamp وكاميرا ومجموعة ملفات وبرامج (MZ16F، MC170 HD، GFP3، LAS 4.12)Leica