الكشف عن تعديلات الهيستون في خلايا الخميرة مع الإفراط في التعبير عن البروتين التنكسي العصبي

الملخص

المصدر: Bennett، S. A.، وآخرون، توصيف تعديلات التعديل اللاحق للترجمة في نماذج اعتلال البروتين التنكسي العصبي للخميرة. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو إجراء تقييم تعديلات الهيستون في خلايا الخميرة التي تفرط في التعبير عن البروتينات التنكسية العصبية. تشمل الخطوات تحلل الخلايا ، والطرد المركزي ، والرحلان الكهربائي ، ونقل الغشاء ، والكشف القائم على الأجسام المضادة للهيستونات المعدلة.

البروتوكول

1. تحلل الخلايا والنشاف الغربي للكشف عن تعديلات ما بعد الترجمة من الهيستون

1. 1. قم بإذابة كريات خلايا الخميرة على الجليد وإعادة تعليق كريات الخلية في 100 ميكرولتر من dH ₂O.
   2. لإعادة تعليق الخلية ، أضف 300 ميكرولتر من 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم و 20 ميكرولتر من 2-ميركابتو إيثانول. قم بالتعليق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
   3. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق ثم الطرد المركزي عند 3,200 × g على جهاز طرد مركزي منضدي لمدة 30 ثانية في RT.
   4. أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من صبغة التحميل 1x واتركها تغلي لمدة 10 دقائق على كتلة تسخين.
      ملاحظة: يمكن العثور على وصفة صبغة تحميل 6x في جدول المواد.
2. الرحلان الكهربائي لجل دوديسيل كبريتات الصوديوم وبولي أكريلاميد ونقل الغشاء
   1. قم بإعداد حجرة الهلام عن طريق وضع اثنين من المواد الهلامية في حامل هلام ، وملء الغرفة الداخلية إلى الأعلى بمخزن مؤقت للتشغيل وملء الغرفة الخارجية بعلامة الخط ثنائية الهلام.
   2. قم بتحميل 15 ميكرولتر من العينة لكل بئر في هلام بولي أكريلاميد 10 آبار بنسبة 12٪. بالنسبة لممر سلم البروتين ، قم بتحميل 5 ميكرولتر.
   3. قم بتشغيل الجل لمدة 45 دقيقة تقريبا عند 150 فولت ، أو حتى تصل مقدمة صبغة التحميل إلى قاع الجل.
   4. أثناء تشغيل الجل ، استعد لنقل الغشاء عن طريق نقع وسادات الألياف (اثنتان لكل هلام) في مخزن النقل المؤقت ( جدول المواد ) ونقع غشاء فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) في الميثانول. اشطف الغشاء في مخزن النقل المؤقت قبل النقل.
      ملاحظة: يجب قطع غشاء PVDF بحجم الجل واستخدام غشاء PVDF واحد لكل هلام يتم نقله.
   5. قم بتجميع "شطيرة" النقل على خلية جهاز نقل شبه جافة: من القطب السفلي ، ضع (1) وسادة ألياف منقوعة مسبقا ، (2) غشاء PVDF منقوع ومغسول مسبقا ، (3) جل ، و (4) وسادة ألياف ثانية منقوعة مسبقا.
      ملاحظة: لتجنب فقاعات الهواء في "شطيرة" النقل ، قم بلف "الساندويتش" برفق باستخدام ماصة مصلية لإجبار الفقاعات. بمجرد وضع الجل فوق غشاء PDVF ، لا تحركه.
   6. لإجراء نقل البروتين ، اضبط حزمة الطاقة على 150 مللي أمبير لمدة ساعة واحدة (ل "شطيرة" واحدة).
3. الكشف عن تعديلات ما بعد الترجمة الهيستونية (PTMs) بالأجسام المضادة الخاصة بالتعديل
   1. إزالة الغشاء من جهاز النقل. اشطف لفترة وجيزة باستخدام dH₂O.
      1. اختياريا ، تحقق من نقل البروتينات مع صبغة Ponceau-S عن طريق سكب ما يكفي من صبغة Ponceau-S لتغطية الغشاء في صندوق بلاستيكي صغير واحتضانه في RT مع رج لطيف لمدة 30-60 ثانية. قم بإزالة بقعة Ponceau-S واشطفها ب dH₂O حتى تختفي بقعة الخلفية وتظهر عصابات البروتين بالعين المجردة. استمر في الشطف باستخدام dH₂O حتى تتم إزالة كل البقعة من الغشاء.
   2. قم بسد الغشاء عن طريق احتضان اللطخة لمدة 1 ساعة في RT مع هزاز لطيف في محلول ملحي مخزن مؤقت (TBS) (جدول المواد ) في صندوق تلطيخ صغير. استخدم ما يكفي من المخزن المؤقت للحجب لتغطية اللطخة.
      ملاحظة: احرص على وضع الغشاء في وضع مستقيم في صندوق التلوين بحيث لا يكون جانب الغشاء الذي تقع عليه البروتينات متجها لأسفل.
   3. احتضان اللطخة في صندوق التلوين طوال الليل باستخدام جسم مضاد خاص بتعديل هيستون يتفاعل تجاه الخميرة عند 4 درجات مئوية. قم أيضا بتضمين التحكم المناسب في التحميل النووي ، مثل H3 المضاد للإجمالي الذي يتم تربيته في نوع مضيف مختلف عن الجسم المضاد الخاص بالتعديل. على سبيل المثال ، إذا كنت تبحث عن H3S10ph بجسم مضاد مضاد ل H3S10ph يتم تربيته في الأرانب ، فاستخدم جسما مضادا مضادا ل H3 يتم تربيته في الفئران كعنصر تحكم في التحميل. كرر هذا لكل لطخة حسب الضرورة.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدام تخفيفات الأجسام المضادة لما مجموعه ثلاث مرات خلال شهر. قم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   4. اغسل الغشاء 4x في TBS محلي الصنع + 0.1٪ بولي سوربات 20 (TBST) لمدة 5 دقائق مع التأرجح في RT.
   5. احتضن اللطخة بالأجسام المضادة الثانوية الفلورية في التخفيفات المحددة من قبل الشركة المصنعة (الحمار المضاد للأرانب 680 والحمار المضاد للفأر) لمدة ساعة واحدة في RT.
      ملاحظة: يجب حماية الأجسام المضادة الثانوية الفلورية من الضوء أثناء التخزين والاستخدام. قم بإجراء الحضانة في صناديق بلاستيكية داكنة أو قم بتغطيتها بورق الألمنيوم.
   6. اغسل الغشاء 4x باستخدام TBST لمدة 5 دقائق واغسله باستخدام TBS لمدة 5 دقائق أثناء التأرجح في RT.
   7. تصور اللطخة على نظام تصوير اللطخة الغربية الفلورية لمدة دقيقتين. تصور الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب 680 ومضادة للفأر 800 في قنوات 800 نانومتر و 700 نانومتر ، على التوالي.
      ملاحظة: يتم إجراء النسخ المتماثلة بشكل مستقل بدءا من القسم 1. لتفسير البيانات المناسب في هذه التجارب ، من الضروري التحقق من أن استجابة إشارة الجسم المضاد تقع ضمن النطاق الذي تكون فيه استجابة الإشارة خطية.

المواد

< فئة الشكل = نمط الجدول = 'العرض: 665 نقطة ؛ '>< فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>< col style = 'العرض: 16.24٪ ؛ '>< col style = 'width: 47.22٪ ؛ '>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td style = 'height: 62.0pt ؛ width: 135pt ؛ '> 10x Running Buffer < td style = 'width: 108pt ؛ '> < td style = 'width: 108pt ؛ '> < td style = 'width: 314pt ؛ ' >مزيج: 141.65 جم جلايسين (ThermoFisher BP381-1) ، 30.3 جم قاعدة Tizma (Sigma-Aldrich T6066) ، 10 جم كبريتات دوديسيل الصوديوم (Sigma-Aldrich L3771) ، و 1 لتر ماء منزوع الأيونات ، درجة الحموضة 8.8.< td style='الارتفاع:31.0pt;العرض:135pt;'>12٪ المواد الهلامية بولي أكريلاميدBIO-RAD456-1041 2-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148 Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary الأجسام المضادةMilliporeSigma07-353 (الدفعة رقم 2762291)diltion: 1/1000Anti-acetyl-Histone H4 (Lys16) Primary Antibody Abcamab109463 (رقم الدفعة. GR187780)diltion: 1/2000Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody Abcamab46983 (Lot No. GR71882)diltion: 1/5000Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary AntibodyAbcamab9049 (Lot No. GR266894 ، GR3236147)diltion: 1/1000Anti-Histone H3 Primary Antibody Abcamab24834 (Lot No. GR236539 ، GR174196 ، GR3194335)< td style = 'width: 314pt ؛ '> التحكم في التحميل النووي ؛ التخفيف: 1/2000المضاد للفوسفو هيستون H2B (Thr129) الجسم المضاد الأساسيAbcamab188292 (رقم الدفعة. GR211874)diltion: 1/1000Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary AntibodyAbcamab5176 (Lot No. GR264582 ، GR192662 ، GR3217296)< td style='width:: 314pt;'>تخفيف: 1/1000BioPhotometer D30Eppendorf6133000010 الطرد المركزي 5804/5804 R / 5810/5810 REppendorf22625501Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CWLI-COR926-32212 (رقم الدفعة C60301-05, C61116-02, C80108-05)التخفيف: 1/5000الحمار المضاد للأرانب IRDye 860 RDLI-COR926-68073 (رقم الدفعة C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)التخفيف: 1/2500EthanolSigma-AldrichE7023 Extra thick blot paper (filterpaper)BIO-RAD1703968 أغشية نقل Immobilon-FL < نمط td = 'العرض: 108pt;'>MilliporeSigmaIPFL00010 Loading Dye Mix: 1.2 جم كبريتات دوديسيل الصوديوم ، 6 ملغ بروموفينول أزرق (Sigma-Aldrich B8026) ، 4.7 مل جلسرين ، 1.2 مل 0.5 م درجة حموضة قاعدة Trizma 6.8 ، 0.93 جم DL-Dithiothreitol ( سيجما ألدريتش D0632) ، و 2.1 مل من الماء منزوع الأيونات.< td style='height:: 15.75pt ؛ العرض: 135pt ؛ '>Methanol < td style = 'width: 108pt ؛ '>ThermoFisher < td style = 'width: 108pt ؛ '>A412-4 < td style = 'width: 314pt ؛ '> < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 135pt ؛ '>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell< td style = 'width: 108pt ؛ '>BIO-RAD1658004 < td style = 'width: 314pt ؛ '> < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 135pt ؛ '> multichannel pipet< td style='width:108pt;'>Eppendorf2231300045 Nuclease Free WaterQiagen129114 Odyssey Fc Imaging SystemLI-COR Biosciences2800-03< نمط TD = 'العرض: 314pt;'> pAG303GAL-a-synuclein-GFPGift from A. Gitler pAG303GAL-ccdBAddgene14133<td style='width:314pt;'> < td style='الارتفاع:15.75pt;; العرض: 135pt ؛ '>pAG303Gal-FUSAddgene < td style = 'width: 108pt ؛ '> 29614 < td style = 'width: 314pt ؛ '> < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 135pt ؛ '>pAG303GAL-TDP-43 < td style = 'width: 108pt ؛ '> هدية من A. Gitler < td style = 'width: 108pt ؛ '> < td style = 'width: 314pt ؛ '> Poly (ethylene glycol) (PEG)Sigma-AldrichP4338 قم بإعداد محلول 50٪ وزن / حجم.Ponceau S StainSigma-AldrichP3504Mix: 0.5 g 0.1٪ w/w Ponceau S dye, 5 مل 1٪ v/v حمض الأسيتيك (Sigma-Aldrich 320099) و 500 مل من الماء منزوع الأيونات.PowerPac Basic Power SupplyBIO-RAD164-5050 Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية. 6X ، مزيج: 1.2 جرام كبريتات دوديسيل الصوديوم ، 6 ملليجرام بروموفينول أزرق ، 0.93 جرام DL-Dithiothreitol ، 2.1 مل ماء منزوع الأيونات ، 4.7 مل جلسرين ، و 1.2 مل 0.5 م قاعدة Trizma ، درجة الحموضة 6.8.هيدروكسيد الصوديومSigma-Aldrich221465Prepare 0.2 M solution.TBS + 0.1٪ Tween 20 (TBST) Mix: 100 مل 10X TBS، 1 مل Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949)، و 900 مل من الماء منزوع الأيونات.< نمط TD = 'الارتفاع: 15.75 نقطة ؛ العرض: 135pt ؛ '>TBS Blocking Buffer < td style = 'width: 108pt ؛ '>LI-COR< td style = 'width: 108pt ؛ '> 927-5000 < td style = 'width: 314pt ؛ '> < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 135pt ؛ '>Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell< td style = 'width: 108pt ؛ '>BIO-RAD 170-3940 < td style = 'width: 314pt ؛ '> < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 135pt ؛ '> Transfer Buffer Mix: 22.5 جم جلايسين ، 4.84 جم قاعدة Tizma ، 400 مل ميثانول ، 1 جم كبريتات دوديسيل الصوديوم ، و 1.6 لتر ماء منزوع الأيونات. tris-buffered Saline (TBS) 10X, 7.6 pH, Solution: امزج 24 جم من قاعدة Trizma و 88 جم من كلوريد الصوديوم (Sigma-Aldrich S7653). املأ حتى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات.< td style='الارتفاع:15.75pt;width:135pt;'>WT 303 S. cerevisiae yeastGift from J. Shorter