توليد نموذج كروي ثلاثي الأبعاد لغزو الخلايا السرطانية

الملخص

المصدر: Guyon, J., et al. نموذج كروي ثلاثي الأبعاد للورم الأرومي الدبقي. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح الفيديو إنشاء نموذج كروي ثلاثي الأبعاد لغزو الخلايا السرطانية. تتكون الكرات الكروية من خلايا ورم الدماغ البشري ومدمجة في مصفوفة الكولاجين. تتبنى الخلايا السرطانية في المحيط الكروي نمطا ظاهريا غازيا ، وتفرز البروتياز لتحلل الكولاجين وتتقدم لغزو المصفوفة المحيطة.

البروتوكول

1. توليد كرويات الورم ذات الحجم المنتظم

ملاحظة: يتم زراعة الخلايا الشبيهة بالجذعية في وسط عصبي قاعدي مكمل بمكمل B27 ، والهيبارين ، وعامل نمو الخلايا الليفية 2 (FGF-2) ، والبنسلين ، والستربتومايسين. تشكل هذه الخلايا تلقائيا كرويات في الثقافة.

1. اغسل الخلايا السرطانية بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات سعة 5 مل (PBS) واحتضن الخلايا بإنزيم تفكك 0.5-1 مل لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
2. اغسل ب 4-4.5 مل PBS وأضف 10 مل من وسط النمو الكامل (الوسط العصبي القاعدي الكامل ، cNBM).
3. عد الخلايا باستخدام تقنية العد التلقائي باستخدام طبقة التربان الزرقاء وشريحة غرفة عد الخلايا.
4. لتوليد 100 كروية مع 10⁴ خلايا لكل كروي (وفقا للحجم المفضل) ، امزج 10⁶ خلايا في 8 مل من NBM مع 2 مل من ميثيل السليلوز 2٪.
5. انقل المعلق إلى حاوية نظام معقم وقم بتوزيع 100 ميكرولتر/بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات في صفيحة سفلية مستديرة سعة 96 بئر.
6. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂ و 95٪ رطوبة. سوف تتشكل كرويات متساوية الحجم ويمكن استخدامها بعد 3-4 أيام.

2. تجارب ثلاثية الأبعاد

1. غزو
   1. التحضير
      1. إعداد مصفوفة الكولاجين في أنبوب على الجليد مع الكولاجين من النوع الأول بتركيز نهائي 1 ملغم/مل ، 1x PBS ، 0.023xV _{كولاجين} ، 1 M هيدروكسيد الصوديوم ، و H المعقم ₂ O. احتضان المحلول على الجليد لمدة 30 دقيقة.
      2. اجمع الكرويات من لوحة البئر القاعية المستديرة في أنابيب 500 ميكرولتر واغسل 2x ب 200 ميكرولتر 1x PBS.
      3. ماصة الكرويات بعناية في 100 ميكرولتر من مصفوفة الكولاجين وإدخالها في وسط البئر في 96 لوحة بئر عادية.
      4. احتضن جل الكولاجين لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ثم أضف cNBM فوق الجل. يمكن إضافة المثبطات أو المنشطات (على سبيل المثال ، كلوريد الهيدروجين كما هو موضح في الشكل 1 ب ، 1 ج }) إلى الوسط في هذه الخطوة.
   2. الحصول على الصور وتحليلها
      1. التقط الصور بالتتابع باستخدام مجهر الفيديو في وضع المجال الساطع بعد 24 ساعة من إدراج الكولاجين.
      2. استخدم فيجي لتحليل الصور إما يدويا أو بطريقة شبه آلية. للقيام بذلك يدويا ، ارسم حول اللب والمساحة الإجمالية للكروي باستخدام أداة التحديد اليدوي وقم بقياس المنطقة الغازية لكل كروي عن طريق طرح المساحة الإجمالية مع المساحة الأساسية. لتحليل الصور بطريقة شبه آلية ، استخدم ماكرو لتحديد المنطقة الغازية.

النتائج

الشكل 1: الورم الأرومي الدبقي P3 كروي في فحوصات الانتشار أو الغزو أو الهجرة. (A) اختبار الانتشار. اللوحة اليسرى: صور تمثيلية مع DMSO كعنصر تحكم أو مع 20 ميكرومتر من روتينون (مثبط مركب السلسلة التنفسية I) في الوقت 0 أو 72 ساعة. اللوحة اليمنى: القياس الكمي للمنطقة الكروية ممثلة كخطوط متقطعة في الصور. مقياس = 250 ميكرومتر. ( ب ) مقايسة الغزو ...

المواد

< فئة الشكل = نمط الجدول = 'العرض: 727pt ؛ '>< فئة الجدول = 'ck-table-ressize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 96 بئر لوحة مستديرة القاعFalcon08-772-212 < td style = 'height: 14.5pt ؛ '>AccutaseGibcoA11105-01مخزنة عند 4 درجات مئوية ، إنزيم تفكك المجالB27Gibco12587مخزنة في -20 درجة مئوية ، تذويب قبل الاستخدام < td style = 'الارتفاع: 14.5pt ؛ '> عامل نمو الخلايا الليفيةالأساسية Peprotech100-18Bمخزنة عند -20 درجة مئوية ، تذويب قبل الاستخدام < td style = 'الارتفاع: 14.5pt ؛'>DPBS 10XPan BiotechP04-53-500مخزنة عند 4 درجات مئوية < td style = 'الارتفاع: 14.5pt ؛ '> ميثيل السليلوزسيجماM0512مخفف في NBM للحصول على تركيز نهائي بنسبة 2٪ < td style = 'height: 14.5pt ؛ '> NBM Gibco 21103-049 مخزنة عند 4 درجات مئوية < td style = 'الارتفاع: 14.5pt ؛ '> Gibco المتوسط العصبي القاعدي 21103049 مخزن عند 4 درجات مئوية < td style = 'height: 14.5pt ؛ '>Penicillin - Streptomycin Gibco 15140-122 مخزنة عند 4 درجات مئوية < td style = 'الارتفاع: 14.5pt ؛ '>النوع الأول من الكولاجين 354236 تخزين Corningعند 4 درجات مئوية