الكشف عن البروتين المرتبط بالأمراض التنكسية العصبية α-Synuclein باستخدام ELISA

الملخص

المصدر: Bétemps، D.، et al.، الكشف عن α-synuclein المرتبط بالمرض عن طريق ELISA المعزز في دماغ الفئران المعدلة وراثيا التي تفرط في التعبير عن A53T البشري α-synuclein. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو إجراء الكشف عن البروتين المرتبط بالأمراض التنكسية العصبية α-سينوكلين في أنسجة المخ من الفئران المعدلة وراثيا باستخدام ELISA. تشمل الخطوات تجانس الأنسجة ، والطرد المركزي ، واكتشاف ELISA لبروتين α-synuclein لتحديد أشكاله المرتبطة بالمرض.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. استخراج α-synnuclein (αS) من مناطق الدماغ التشريح

1. قم بتشريح دماغ كامل في طبق بتري بلاستيكي مقاس 35 مم على الجليد باستخدام مكبر منخفض الطاقة (تكبير 8X) باستخدام اثنين من الرؤوس التي يتم الاحتفاظ بنهاياتها معا إلا عند تشريح الحصين. لا تتجاوز 10 دقائق للحفاظ على سلامة الدماغ. ضع الدماغ على الجانب الأيمن لأعلى واسترجع مناطق الدماغ التالية بهذا الترتيب:
   1. افصل بين المصباحين الشميتين باستخدام ملقط يوضع خلفه مباشرة. افصله عن الدماغ عن طريق تحريكه لأسفل. كرر هذه العملية للمصباح الثاني.
   2. قم بربط الملقط برفق بين القشرتين وحركها للأمام لتسهيل تفكك القشرتين. الحفاظ على الدماغ في مكانه باستخدام ملقط واحد ، استخدم آخر لفصل القشرة عن الحصين.
   3. ضع الملقط 2 مم أسفل القشرة. حافظ على ضغط لطيف على الملقط حتى يظهر الجزء العلوي من الحصين. انزع الجزء الأول من القشرة ، وكرر العملية مع الجزء الثاني. استخدم الملقط لفصل القشرتين بدءا من الحصين والتحرك نحو مقدمة الدماغ.
   4. ضع الملقط المفتوح حول أحد الحصين. أغلق الملقط الموجود في الجزء السفلي من الحصين ثم قم بإزالته برفق ، واسترجع قدر الإمكان. كرر الإجراء للحصين الثاني.
   5. ضع الملقط المفتوح أسفل أحد المخططات وافصله برفق عن الدماغ. استخدم الملقط لإزالة أي قشرة متبقية من المخطط. كرر هذا الإجراء للمخطط الثاني.
   6. استخدم الملقط لضغط محيط المخيخ بمقدار 2 مم لتسهيل انفصاله عن الدماغ. ضع الملقط خلف المخيخ مباشرة وقم بإزالته عن طريق تحريك الملقط للأمام.
   7. استخدم الجزء العريض من الملقط لرفع الدماغ المتوسط من أجل رؤية المكان الذي ينضم إليه بوضوح إلى جذع الدماغ. قم بعمل شق عمودي عند التقاطع ثم قم بإزالة جذع الدماغ.
   8. ضع الملقط خلف الدماغ المتوسط، الذي يتكون من أربعة هياكل مستديرة. شق عموديا حتى يتم فصل الدماغ المتوسط تماما عن الدماغ المتبقي.
2. تحضير متجانسات بنسبة مئوية متغيرة (الوزن / الحجم) في عازلة عالية الملح (HS) ، اعتمادا على عدد الأنسجة المتاحة: 5٪ تجانس لوزن يتراوح بين 10 و 30 مجم ، و 10٪ لوزن يتراوح بين 30 و 80 مجم ، و 20٪ لوزن أعلى من 80 مجم.
   1. أضف حجما كافيا من المخزن المؤقت HS إلى مناطق الدماغ التي تم تشريحها للحصول على النسبة المئوية المتوقعة من التجانس.
   2. Vortex وتحقق من أن الأنسجة مغمورة بالكامل في المخزن المؤقت HS.
   3. تجانس العينات المحضرة من مناطق الدماغ المقطعة أو الحبل الشوكي العنقي باستخدام طاحونة أنسجة مكونة من أنبوب زجاجي من البورسليكات ومدقتين ، A و B.
   4. صب كل منطقة من الدماغ ليتم سحقها مباشرة في الأنبوب. أدخل المدقة A في الأنبوب وسحبها. كرر هذه الحركة حوالي عشر مرات لفصل الأنسجة. ثم استخدم المدقة B لمواصلة طحن الأنسجة ب 20 حركة أخرى. انقل المتجانسات إلى أنبوب سعة 1.5 مل باستخدام ماصة نقل 1 مل.
3. الطرد المركزي للعينات عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية للتخلص من أي شظايا دماغية غير أرضية. استرجع المواد الطفية ، وقسمها إلى 200 ميكرولتر ، واحتفظ بها عند -80 درجة مئوية للتحليل اللاحق.

1. الكشف عن αS بواسطة ELISA

1. تمييع الأجسام المضادة للطلاء إلى 0.01 نانوغرام/مل. استخدم إما أجسام مضادة للأرانب متعددة النسيلة أو أحادية النسيلة 42 في 50 ملي مولار Na₂CO₃ / NaHCO₃ عازلة (الرقم الهيدروجيني 9.6).
2. قم بتغطية الألواح الدقيقة المكونة من 96 بئرا بسعة 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول الطلاء هذا، واتركها عند 4 درجات مئوية O / N. استخدم الجسم المضاد متعدد النسيلة للأرانب المضاد للαS في محلول الطلاء ل ELISAs باستخدام الأجسام المضادة للكشف syn514 أو clone 42 أو LB509 أو AS11 أو 4D6 أو 8A5. استخدم استنساخ الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل αS 42 كمحلول طلاء مع الجسم المضاد للكشف عن αS المضاد ل pSer129.
   NOTE: إذا لزم الأمر، يمكن الاحتفاظ بالألواح عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد قبل إجراء ELISA.
3. استخدم غسالة الألواح لغسل الألواح خمس مرات باستخدام 300 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات مع 0.05٪ Tween 20 (PBST) لكل بئر. من هذه الخطوة فصاعدا ، تكون الحضانة في RT.
4. أضف 200 ميكرولتر من T20 PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) لكل بئر. رج العبوة لمدة 1 ساعة عند 150 دورة في الدقيقة. اغسل الأطباق خمس مرات باستخدام PBST.
5. تمييع متجانسات الدماغ (التخفيف 1:100 من 20٪ متجانسات ، 1:50 من 10٪ متجانسات ، و 1:25 من 5٪ متجانسات في PBST BSA 1٪) ، وأضف 100 ميكرولتر إلى كل بئر. ثم احتضن لمدة ساعتين أثناء الاهتزاز عند 150 دورة في الدقيقة. اغسل الأطباق خمس مرات باستخدام PBST.
6. أضف الأجسام المضادة المختلفة للكشف عن αS في PBST مع ألبومين مصل الأبقار (BSA) 1٪ عند التخفيفات المذكورة في قائمة المواد. احتضان لمدة 1 ساعة عند 150 دورة في الدقيقة. اغسل الأطباق خمس مرات باستخدام PBST.
7. أضف إما مضاد للفأر أو مضاد للأرانب IgG HRP مقترف مخفف 1: 8,000 في PBST مكملا ب BSA 1٪ لمدة ساعة واحدة أثناء الاهتزاز عند 150 دورة في الدقيقة. اغسل الأطباق خمس مرات باستخدام PBST.
8. أضف 100 ميكرولتر من محلول 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) إلى كل بئر واحتضنه لمدة 15 دقيقة في الظلام أثناء الاهتزاز عند 150 دورة في الدقيقة.
9. أوقف التفاعل بإضافة 100 ميكرولتر من 1 N HCl لكل بئر ثم قم بقياس الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة.
10. لتحليل البيانات، اطرح قيمة OD التي تم الحصول عليها في بئر مع جميع الكواشف باستثناء أي عينات من دماغ الفأر (بئر فارغ) من قيم OD المقاسة لكل عينة من العينات التي تم تحليلها.

المواد

<فئة الشكل = نمط "الجدول" = "العرض: 1000pt;'>< td style='الارتفاع:15.5pt;width:200pt;'>AS11< نمط TD = 'الارتفاع: 15.5 نقطة ؛ العرض: 200 نقطة ؛ '>Syn514< td style='width:200pt;'> طلاء الجسم المضاد< نمط td = 'الارتفاع: 15.5pt ؛ العرض: 200pt ؛ '>مضاد للفأر IgG HRP مترافق < td style = 'width: 200pt ؛ '> < td style = 'width: 200pt ؛ '>Southern Biotech < td style = 'width: 200pt ؛ '> 1010-05 < td style = 'width: 200pt ؛ '> < td style = 'height: 15.5pt ؛ width: 200pt ؛ '> Anti-rabbit IgG HRP conjugate < td style = 'width: 200pt ؛ '> < td style = 'width: 200pt ؛ '>Southern Biotech < td style = 'width: 200pt ؛ '> 4010-05 < td style = 'width: 200pt ؛ '> < td style = 'height: 15. 5pt;width:200pt;'>NaCl 750 mM< td style='الارتفاع:15.75pt;width:200pt;'>NaCl 137 mM< td style='width:200pt;'> < td style='الارتفاع:15.75pt;العرض:200pt;' >BSA المؤقت < td style = 'width: 200pt;'> tubes steps< td style='width:200pt;'>

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
LB509		Abcam	ab27766	Detection Antibody 1/2000
	Produced at Anses		Detection Antibody 1/1000
4D6		Abcam	ab1903	Detection Antibody 1/2000
PSer129		Abcam	ab59264	Detection antibody 1/3000
PSer129 EP1536Y		Abcam	ab51253	Detection Antibody 1/1000
	Abcam	ab24717	Detection Detection body المضاد 1/500
Clone 42		BD Biosciences	610787	طلاء وكشف الجسم المضاد (1/2000)
8A5		Provided by Dr. Anderson		Detection antibody 1/2000
Polyclonal antibody antibody syn antibody		Millipore	AB5038P
' IgG HRP المضاد للفأر		Dianova	115-035-164
HS buffer	Tris-HCl 50 mM	Euromedex	26-128-3094-B	اضبط عند درجة الحموضة 7.5 واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية
Euromedex	1112-A
EDTA 5 mM	Euromedex	EU0007-B
DTT 1 mM	Sigma	43815
PBS	فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم 1 mM	Euromedex	1309	ضبط عند الرقم الهيدروجيني 7.5
Monopotassium phosphate 1.5 mM	Euromedex	2018
Euromedex	1112-A
KCl 2.7 mM	Euromedex	P017
Tween 20		Euromedex	2001-C
	Sigma	A7906
Microplate MaxiSorpTM		Thermo Scientific	442404
كربونات السدادة القطنية 50 ملي مولار الرقم الهيدروجيني 9.6	ديكاهيدرات كربونات الصوديوم	Sigma	71360	2.86 g/L
بيكربونات الصوديوم	Merk	6329	3.36 g/L, pH9.6
Superblock T20 PBS حجب المخزن	Pierce	E6423H	10 X focusd
TMB		Sigma	T0440	used for ELISA
TMB		Analytik Jena AG	847-0104200302	used for epitope mapping
HCl 1N		Chimie plus	40030
Ribolyser		Thermo	Fast prep FP120	Keep on ice at this Step
Grinding		Biorad	355-1197
Plate Washer		Tecan	Columbus Pro
Plate reader		Biorad	Model 680
low power magnifier		VWR	630-1062	X8 magnification
Ripps Dumont#7		WPI	14097	for the sect
Transfer pipette 1ml Samso	Samso	43231
1.5 ml tubes		Dutscher	33290