نمذجة ورم خبيث في الدماغ عن طريق حقن الشريان السباتي الداخلي للخلايا السرطانية

الملخص

المصدر: Lim, M., et al. نمذجة ورم خبيث في الدماغ عن طريق حقن الشريان السباتي الداخلي للخلايا السرطانية. J. Vis. Exp. (2022)

في هذا الفيديو ، يخضع فأر مخدر لعملية جراحية يتم فيها حقن الخلايا السرطانية في الشريان السباتي المشترك (CCA) لتسهيل التوصيل المستهدف إلى الدماغ. يتضمن الإجراء خياطة دقيقة ومعالجة الشرايين السباتية لتوجيه الخلايا المحقونة نحو الشريان السباتي الداخلي (ICA) ، مما يعزز تكوين الورم في الدماغ بمرور الوقت.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالنماذج الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تحضير الخلايا السرطانية للحقن

ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام خط خلايا سرطان الثدي البشري ، BT-474 (BT474). تم استزراع BT474 في وسط نمو كامل يشتمل على RPMI (معهد روزويل بارك التذكاري المتوسط) 1640 متوسط مع 10٪ مصل بقري للجنين و 1٪ أنسولين. تم الاحتفاظ بالخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي للهواء. مصادقة خط الخلية عن طريق الاختبار الترادفي عبر الأقمار الصناعية ، وتأكيد التعبير عن بروتين المراسل (على سبيل المثال ، لوسيفيراز) ، إن وجد ، والتحقق من وجود عدوى الميكوبلازما.

1. قم ببذور الخلايا السرطانية BT474 بكثافة بذر 2.0 × 10 ^ 6 خلايا في قارورة T75 باستخدام 10 مل من وسائط النمو الكاملة والثقافة (عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون) إلى 70٪ -80٪ التقاء قبل الحقن.
2. في يوم الحقن ، تخلص من وسائط النمو واغسل الخلية أحادية الطبقة مرتين بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
3. أضف 5 مل من كاشف تفكك ثقافة الخلايا الدافئ مسبقا واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى تنفصل الخلايا. بعد 5 دقائق ، اضغط برفق على القارورة للمساعدة في انفصال الخلية.
4. أضف 5 مل من وسائط النمو الكاملة التي تحتوي على 10٪ مصل بقري الجنين لإخماد نشاط كاشف التفكك.
5. أعد تعليق الخلايا برفق عن طريق سحب العينة لتقليل تكتلات الخلايا.
6. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 180 × g لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
7. صب المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) بدون الكالسيوم والمغنيسيوم لتقليل تكتل الخلايا.
8. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية في درجة حرارة الغرفة عند 180 × g لمدة 3 دقائق.
9. {{}} صب المادة الطافية لإزالة كاشف المصل / الانفصال المتبقي وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 3 مل من HBSS.
10. ضع مصفاة خلية 100 ميكرومتر على أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل وقم بتمرير معلق الخلية لإزالة كتل الخلايا.
    ملاحظة: يعد التعليق أحادي الخلية ضروريا لتقليل انسداد الأوعية الدموية وخطر الإصابة بالسكتة الدماغية عند الحقن.
11. احسب عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام استبعاد Trypan Blue ومقياس كثافة الدم باستخدام الطرق القياسية.
12. قم بتخفيف معلق الخلية باستخدام HBSS إلى تركيز خلية 2.5 × 10 ⁶ خلايا / مل.
13. حافظ على الأنبوب أفقيا على الجليد وهز الأنبوب برفق بشكل دوري لتقليل التكتل. يمكن تخزين تعليق الخلية على الجليد لمدة أقصاها 6 ساعات.
    } ملاحظة: تم التأرجح يدويا ، ولكن يمكن أيضا القيام بذلك باستخدام شاكر عند عدد دورات منخفض في الدقيقة.

2. تحضير الماوس للإجراء

ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام إناث الفئران NOD البالغة من العمر 4-5 أسابيع. قدم طعاما للتعافي من النظام الغذائي الناعم (على سبيل المثال ، هلام الدايت ، الهيدروجيل ، طعام الفأر المهروس) للفئران قبل 3 أيام من الإجراء لتشجيع التغذية بعد العملية.

1. أدوات الأوتوكلاف الجراحية. رش ومسح المنطقة الجراحية والمعدات بمطهر الأسطح ، متبوعا بنسبة 70٪ إيثانول.
2. ضع حصيرة حرارية للحيوانات أسفل اللوح الجراحي لمنع انخفاض حرارة الجسم. قم بتشغيل هذا قبل 30 دقيقة من الجراحة. رش وامسح اللوح الجراحي بمطهر الأسطح ، متبوعا بنسبة 70٪ إيثانول.
3. قم بإعداد قفص سكن نظيف ووسادة تدفئة دافئة للتعافي.
4. ارتد معدات الحماية الشخصية النظيفة (ثوب ، قناع ، ناموسية شعر ، وقفازات). حافظ على العقم طوال العملية باستخدام قفازات الفحص النظيفة وتقنية "نصائح الأدوات فقط".
5. قم بتخدير الفأر بغرفة التخدير باستخدام 5٪ إيزوفلوران مع تدفق أكسجين 2 لتر / دقيقة حتى يفقد الماوس منعكس الدواسة.
6. أخرج من الغرفة وضعه في مخروط الأنف الذي يوفر 2٪ إيزوفلوران بتدفق أكسجين 2 لتر / دقيقة للإجراء الجراحي المتبقي.
7. ماوس لكمة الأذن لتحديد واستخدام المقصات الكهربائية لحلاقة الفراء من منطقة الرقبة. نظف الشعر الزائد من الجلد المكشوف باستخدام شريط لاصق.
8. قم بوزن الفأر لحساب جرعات المخدر والمسكنات المطلوبة. يتم تطبيق البوبرينورفين والميلوكسيكام بمعدل 50 ميكروغرام/كغ و1 ملغم/كغ، على التوالي، عن طريق الحقن تحت الجلد.
9. انقل الماوس إلى لوح جراحي دافئ وقم بتأمين مخروط الأنف بشريط لاصق.
10. ضع مادة تشحيم العين على العينين لمنع الجفاف.
11. قم بتأمين الماوس برفق عن طريق تثبيت أسنان القواطع العلوية أولا باستخدام خيط ملصق على لوح الجراحة ، متبوعا بلصق الساقين الأمامية والخلفية. تعمل هذه الخطوة على تمديد الجسم وتحافظ على استقامة الرقبة أثناء العملية.
12. قم بإجراء تحضير الجلد قبل الجراحة كما هو موضح أدناه.
    1. امسح الرقبة بمطهر موضعي (بوفيدون - يود) لتقليل حمل البكتيريا في الجلد وإزالة الشعر المتساقل. نظف من منتصف الجلد ، واعمل للخارج لمنع إعادة تلوث موقع الشق. كرر العملية باستخدام 70٪ إيثانول. قم بإجراء ثلاث جولات متناوبة من اليود والإيثانول للتطهير.
    2. ضع ستارة جراحية فوق. يتم قصها وتشكيلها من قطعة من منشفة ورقية معقمة أو كيس الأوتوكلاف.
13. ضع مناشف ورقية معقمة أو أكياس الأوتوكلاف للأدوات الجراحية.
14. تحقق من وجود رد فعل } عن طريق 'اختبار القرصة' لضمان التخدير الكافي قبل متابعة الإجراء.

3. حقن الشريان السباتي الداخلي

ملاحظة: في هذه التجربة ، تم استخدام قنية التسريب 31 جيجا وإعداد سائق الحقنة المنشط بالقدم لتسهيل إجراء الحقن. هذا الإعداد اختياري ، ويمكن للمستخدم استخدام حقنة الأنسولين 31 جيجا وتخطي الخطوتين 3.11 و 3.12. لتحضير قنية التسريب ، اسحب جزء الإبرة وافصله عن جزء تركيب المحقنة من إبرة 31 جم باستخدام زوجين من مشابك الخياطة. بعد ذلك ، قم بتوصيل جزء الإبرة بأحد طرفي أنبوب التسريب الناعم الذي يبلغ طوله حوالي 10 سم.

1. ضع مجهر التشريح فوق الماوس.
2. باستخدام المقص ، قم بعمل شق رأسي 15 مم على طول خط الوسط في منطقة الرقبة بدءا من 5 مم أسفل الفك إلى مدخل الصدر.
3. باستخدام زوجين من الملقط الزاوي ، قم بتقسيم الجلد والغدد اللعابية الأساسية وقم بتطبيق ضادات لإبقاء القصبة الهوائية مكشوفة. ستكشف الخطوة التالية عن غمد الشريان السباتي الذي يقع بالتوازي مع القصبة الهوائية.
4. باستخدام زوجين من الملقط ذو الزاوية الدقيقة ، قم بتشريح العضلات والأنسجة الدهنية المجاورة للقصبة الهوائية بصراحة لفضح غمد الشريان السباتي الأيمن. غمد الشريان السباتي هو الطبقة الليفية التي تغطي الشريان السباتي المشترك والوريد والعصب المبهم ، ويمكن تصور هذه الحزمة بواسطة الشريان السباتي المشترك الأحمر الفاتح. في هذه الدراسة ، تم إجراء الحقن على الشريان السباتي الأيمن.
5. قم بمسح جزء من الذيلية للشريان السباتي المشترك إلى التشعب السباتي للفافة المحيطة وافصله عن العصب والأوردة المبهمة.
6. عزل وإزالة التشعب السباتي (الوصلة التي تربط الشرايين السباتية الخارجية والداخلية) من الأعصاب واللفافة المحيطة. ضع ملقطا دقيقا تحت الشريان السباتي الخارجي ومرر خياطة حريرية (سمك 5-0) تحت الشريان. عقدة وتشديد الخيط وقطع الخط الزائد.
   ملاحظة: سيمنع هذا الرباط (L1) الحقن من المرور عبر الشريان السباتي الخارجي.
7. ضع ملقطا دقيقا تحت الشريان السباتي المشترك ومرر خياطة حريرية (سمك 5-0) تحت الشريان. اربط عقدة وشد الخيط في وضع قريب من موقع الحقن المقترح. قطع الخيط الزائد ، وترك حوالي 10 مم من الخط.
   ملاحظة: هذا الرباط الثاني (L2) سيقيد تدفق الدم والنزيف بعد الحقن. كما أنها تستخدم لوضع الشريان السباتي والاحتفاظ به أثناء الحقن.
8. قص وترطيب شريطا من المساحات منخفضة الوبر (المعقمة) التي تستخدم لمرة واحدة حوالي 10 مم × 5 مم. قم بطي الشريط إلى 4 مم × 5 مم ، بسمك 2-3 مم ، وضعه أسفل الشريان السباتي في موقع الحقن المقترح. سيدعم هذا الوعاء أثناء الحقن.
9. على الشريان السباتي المشترك المنقاري إلى موقع الحقن المقترح ، ضع ربطا ثالثا (L3) بعقدة فضفاضة. يتم تشديد هذا فقط بعد الحقن (في الخطوة 3.16).
10. حرك تعليق الخلية برفق واسحب 200 ميكرولتر من تعليق الخلية في حقنة الأنسولين (بإبرة 31 جرام).
11. قم بتحميل المحقنة في مشغل الحقنة ، المتصل بدواسة القدم المنشطة.
12. قم بتوصيل قنية دقيقة بإبرة 31 جم بالمحقنة وقم بتجهيز الخط.
13. تحقق مما إذا كان الشريان السباتي في وضع جيد ومضغوط.
14. باستخدام ملقطين بزاوية دقيقة ، أحدهما يشد برفق على نهاية الرباط الأول والآخر يحمل إبرة 31 جم ، أدخل الإبرة ببطء مع شطبة في تجويف الأوعية الدموية مع الحرص على عدم ثقبها.
15. حقن 100 ميكرولتر من معلق الخلية ببطء (من الخطوة 1.13) في الشريان السباتي المشترك بسرعة 10 ميكرولتر / ثانية. سيؤدي ذلك إلى توصيل 2.5 × 10 ^ 5 خلايا في الأوعية الدموية. يتم تصور الحقن الناجح } عن طريق تطهير الدم من الأوعية الدموية السباتية.
16. ارفع وشد الرباط السائب برفق (L3) (من الخطوة 3.9) مباشرة بعد سحب الإبرة لمنع التدفق العكسي والنزيف. تقليم الخيط الزائد.
    ملاحظة: من الطبيعي ملاحظة تدفق كمية صغيرة من الدم بعد سحب الإبرة. ومع ذلك ، يجب ألا يكون هناك أي نزيف نشط بعد شد الرباط الثالث.
17. قم بإزالة قطعة المساحات المبللة منخفضة الوبر التي تستخدم لمرة واحدة.
18. باستخدام ماصة P200، اشطف التجويف الجراحي مرتين ب 150-200 ميكرولتر من الماء المعقم أو المحلول الملحي.
19. تحقق مرة أخرى من النزيف ، ثم قم بإزالة الضاعرات.
20. أعد وضع الأنسجة الرخوة والغدد اللعابية والجلد فوق الشريان السباتي والقصبة الهوائية.
21. أغلق طبقة جلد الشق باستخدام حامل إبرة خياطة ، ملقط ، وخياطة أحادية قابلة للامتصاص أو غير قابلة للامتصاص 6/0 بنمط مستمر.
22. تخلص من حقنة إبرة القنية وقم بإعداد إعداد جديد للماوس التالي. سيضمن استخدام حقنة جديدة أن عدد الخلايا التي يتم حقنها في كل فأر متسق.
    ملاحظة: اللقطات التمثيلية للإجراء موجودة في حالة ثقب الوعاء الدموي أو تمزقه بالإبرة، يشار إليه بتسرب الحقن أو النزيف، يعتبر الإجراء غير ناجح. بعد ذلك ، يجب سحب الإبرة ، ويجب شد الرباط الثالث على الفور لمنع المزيد من النزيف. إذا استمر النزيف بعد شد الخيط ، فيجب القتل الرحيم للحيوان باستخدام البنتوباربيتال.

4. التعافي بعد الحقن

1. حقن البوبرينورفين (50 ميكروغرام/كجم) وميلوكسيكام (1 ملغم/كجم) } الحقن تحت الجلد لتخفيف الآلام بعد الجراحة.
2. انقل إلى قفص دافئ ونظيف للتعافي من التخدير. من الطبيعي أن يكون للحيوان نشاط ضعيف (متجمعة وغير نشطة أو يتحرك ببطء) بعد الاستيقاظ.
3. بعد 30-45 دقيقة ، انقل الفئران إلى منشأة احتجاز طويلة الأجل.
4. زود الفئران بنظام غذائي ناعم (هلام دايت ، هيدروجيل ، هريس) لمدة أسبوع على الأقل بعد الجراحة وتحقق من الحالة البدنية يوميا مع إيلاء اهتمام خاص لعلامات السكتة الدماغية والعدوى والنزيف حول موقع الجرح.
5. بعد يومين من الجراحة ، من المعتاد أن يكون لدى نشاط منخفض ، وفراء مكشكش خفيف ، وفقد 15٪ من وزن الجسم قبل الجراحة. تطبيق مسكن (ميلوكسيكام) يوميا لمدة 2-3 أيام بعد الجراحة للتحكم في الألم والمساعدة على التعافي.
6. من اليوم 3 فصاعدا ، يجب أن تكون قد استعادت نشاطها ، وزادت من وتيرة التغذية والاستمالة ، واستعادت الوزن. القتل الرحيم للحيوانات التي تعاني من عجز مستمر في الحالة البدنية (الألم ، التجمع ، غير النشط ، فقدان الوزن) بعد 4 أيام بعد الجراحة عن طريق حقن البنتوباربيتال الصوديوم بمعدل 200 مجم / كجم عن طريق الحقن داخل الصفاق.
7. يمكن مراقبة نقش الورم وتطوره باستخدام طريقة التخدير والتصوير المفضلة ، مثل التصوير الحيوي أو التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني / التصوير بالرنين المغناطيسي. ستعتمد متطلبات والقدرة على إجراء مثل هذا التصوير بطبيعتها على أهداف المشروع الفردية والمنشأة التي يتم تنفيذها فيها ، واعتمادا على نوع علامة المراسل ، وخطوط الخلايا المستخدمة ، وإمكانية الوصول إلى الكيمياء الإشعاعية ذات الصلة ومرافق التصوير النووي } .
   ملاحظة: قد لا تستجيب بعض بشكل جيد وتعاني من سكتة دماغية على الرغم من الإجراء الناجح. بعد العملية ، يجب القتل الرحيم على الفور للحيوانات التي تظهر عليها أي أعراض للضائقة العصبية (تدوير الرأس والسحب إلى جانب واحد ، والسلوك الدائري ، والدحرجة ، والضرب ، وفقدان الوظيفة الحركية).

النتائج

الشكل 1: تمثيل تخطيطي لبروتوكول حقن الشريان السباتي الداخلي للورم الخبيث في الدماغ. يمكن أن ينتج عن حقن الشريان السباتي الداخلي مع ربط الشريان السباتي الخارجي بشكل موثوق نموذج ورم خبيث في الدماغ من أنواع مختلفة من السرطانات الأولية. في هذا البروتوكول ، يتم وضع ثلاثة أربطة على الشريان السباتي (موضح ك L1-L3 في الشكل).

المواد

<فئة الشكل = نمط الجدول = 'العرض: 852pt ؛ '><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>< نمط العمود = 'العرض: 23.12٪ ؛ '>< col style = 'width: 5.64٪ ؛ '>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td style = 'height: 14.5pt ؛ '> 30G Microlance needleBD23748 31G Ultra-Fine II حقنة الأنسولينBD326103 ملقط بزاويةProscitechT67A-SSمدبب دقيق، بزاوية بدون مسننة، طرف 18 مم، طول 128 ممحصيرة حرارة المضادات الحيوية والمضادة للفطرياتThermoFisher Scientific15240062 BT-474 (HTB-20) خط خلايا سرطان الثديATCCHTB-20 Buprenorphine (TEMGESIC) عداد خلايا الكونتيسةThermoFisher ScientificC10227 مجهر تشريح <نمط td = 'الارتفاع: 14.5pt ؛ '>الأذن المزاك <نمط TD = 'الارتفاع: 14.5pt ؛ '> المقص الكهربائي <نمط td = 'الارتفاع: 14.5pt ؛ '>ملقط بزاوية دقيقةProscitechDEF11063-07بزاوية 45 درجة ، طرف ناعم ، عرض الطرف: 0.4 مم ، أبعاد الحافة: 0.4 × 0.3 مم ، الطول 9 سم < نمط td = 'الارتفاع: 14.5pt ؛ '> أنابيب دقيقة للقنية ، الأنابيب OD (في) 1/32 ، معرف الأنابيب (بوصة) 1/100 بوصةكول بارمرEW-06419-00 مصل الأبقار الجنينيThermoFisher Scientific < td style = 'text-align: right ؛ '>26140079 < td style = 'height: 14.5pt ؛ '>Hank's Balanced Salt Solution بدون الكالسيوم والمغنيسيومThermoFisher Scientific < td style = 'text-align: right;'>14170120 isoflurane Kimwipes مساحات منخفضة الوبر يمكن التخلص منهاKimberly Clark- KimwipesZ188964 مهروس الماوس chow Meloxicam (METACAM) Nose cone مصنوع من أنبوب ميكروفيوج < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ '> مواد تشحيم العين PAA (Carbomer 2mg / g) Bausch and lomb Povidone - iodine solutionBetadine < td style = 'text-align: right;'>2505692 < td style = 'height: 15.75pt ؛ '> PPE (قفازات ، قناع ، ثوب ، شعر) RetractorsKent ScientificSURGI-5001 RPMI 1640 MediaThermoFisher Scientific11875093 Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cmEthiconJJ-640G Metile Normal SalineThermoFisher ScientificTM4469 الشريط اللاصق لوح الجراحة لوح تقطيع ملفوف بكيس قابل للتعقيم.< td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ '> مقص جراحيProscitechT104 أبعاد الطرف (LxD): 38 × 7 مم ، الطول 115 مم < نمط td = 'الارتفاع: 15.75 نقطة ؛' > ملقط خياطة / ملقط بروفي منحنيProscitechT113Cمنحني ، طرف ضيق مستدير 2 مم ، مع مسننات ، طول 165 مم < نمط td = 'الارتفاع: 15.75pt ؛'>حامل إبرة خياطة (حامل إبرة Olsen Hegar) ProscitechTC1322-180طول 190 مم ، مشبك السقاطةسائق حقنة مع دواسة القدم/UMP3 مضخة فائقة الصغرالعالمية للأدواتالدقيقة UMP3-3 قارورة زراعة الأنسجةT75 ThermoFisher Scientific156499 Thread Trigene II مطهر الأسطحCeva