تحليل LC-MS / MS للملف البروتيني لحبيبات الميلانين العصبي المعزولة من أنسجة المخ البشري

الملخص

المصدر: Wulf, M., et.al. بروتوكول قائم على التشريح المجهري بالليزر لتحليل LC-MS / MS للملف البروتيني لحبيبات الميلانين العصبي. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو تحليل عينات الببتيد من حبيبات الميلانين العصبي (NMGs) المعزولة من أنسجة المخ البشرية بعد الوفاة. يتم فصل الببتيدات أولا باستخدام كروماتوغرافيا السائل عالية الأداء (HPLC) ثم يتم تحليلها بواسطة قياس الطيف الكتلي لتحديد نسب الكتلة إلى الشحنة (م / ز). يتم تجزئة الببتيدات المستهدفة لتحديد التعديلات اللاحقة للترجمة وتتم مقارنة البيانات الناتجة بقاعدة بيانات مرجعية لتحديد الملف الشخصي البروتيني ل NMGs.

البروتوكول

1. الهضم الترجلي

1. قم بفك تجميد العينات على الثلج.
2. جفف العينات تماما في مكثف فراغ.
3. املأ العينة ب 50 ميكرولتر من مخزن مؤقت مناسب للهضم ، على سبيل المثال ، 50 ملي مولار بيكربونات الأمونيوم.
4. بعد إضافة 1.25 ميكرولتر من 200 ملي مولار 1،4-ديثيوثريتول ، احتضان العينات لمدة 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية و 300 دورة في الدقيقة باستخدام خلاط حراري وقم بتبريدها إلى درجة حرارة الغرفة (RT) بعد ذلك.
5. بعد ذلك ، احتضان العينات في RT لمدة 30 دقيقة في الظلام بعد إضافة 1.36 ميكرولتر 0.55 M يودوأسيتاميد.
6. أضف كمية مناسبة من التربسين إلى العينات واحتضان العينات طوال الليل (~ 16 ساعة) عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: بالنسبة ل 1،000،000 ميكرومتر² ، تم العثور على 0.1 ميكروغرام من التربسين لتكون كافية.
7. أضف 2.6 ميكرولتر من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 10٪ (TFA) إلى العينات لوقف الهضم (التركيز النهائي 0.5٪ TFA).
8. جفف العينات تماما باستخدام مكثف فراغ. بعد ذلك ، املأ العينات حتى حجم نهائي محدد بنسبة 0.1٪ TFA. تم ملء عينات NMG حتى 20 ميكرولتر منها 5 ميكرولتر تم استخدامها لتجربة واحدة لقياس الطيف الكتلي (MS).
9. قم بتخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر. تحديد تركيز الببتيد عن طريق تحليل الأحماض الأمينية أو طريقة أخرى مناسبة للقياس الكمي (على سبيل المثال ، الكشف المباشر).
ملاحظة: قد لا تكون كميات العينات المنخفضة قابلة للقياس الكمي باستخدام التقنيات المذكورة. لضمان تحميل العينة المتطابقة ، يجب أن تحتوي كل عينة على نفس الكمية من الأنسجة المعزولة ، ويجب معالجة كل عينة بالتساوي.

2. الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء وقياس الطيف الكتلي

ملاحظة: تم تحسين التحليلات الطيفية الكتلية (MS) التالية للكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) لنظام LC المحدد باستخدام جهاز عمود الاصطياد ومطياف الكتلة المستخدم هنا (انظر جدول المواد). بالنسبة لأنظمة LC و MS الأخرى ، يوصى بتكييف المعلمات.

1. باستخدام برنامج Xcalibur، اضبط إعدادات HPLC على النحو التالي.
   1. Trap column: اضبط درجة الحرارة على 60 درجة مئوية، ومعدل التدفق على 30 ميكرولتر/دقيقة، وتشغيل المخزن المؤقت إلى 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك.
   2. عمود الطور العكسي C18 التحليلي: اضبط درجة الحرارة على 60 درجة مئوية، ومعدل التدفق على 30 ميكرولتر/دقيقة، وتشغيل المخزن المؤقت A إلى 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك، وتشغيل المخزن المؤقت B إلى 84٪ أسيتونيتريل، والتدرج إلى 5٪ -30٪ تشغيل المخزن المؤقت B على مدار 98 دقيقة.
      NOTE: قد يكون تكيف التدرج أمرا لا مفر منه ويوصى به بشدة عند استخدام أنسجة أو خلايا مختلفة. قد يختلف إجمالي وقت التدرج بسبب تحميل العينة في بداية التدرج وغسل العينة في نهاية التدرج. يتكون التدرج الكلي في هذا البروتوكول من تحميل عينة لمدة 7 دقائق وغسل عمود إضافي لمدة 15 دقيقة مما يؤدي إلى وقت تدرج إجمالي يبلغ 120 دقيقة.
2. قم بإنشاء طريقة اكتساب تعتمد على البيانات (DDA) باستخدام XCalibur Instrument Setup، والتي يمكن العثور عليها في قائمة خارطة طريق برنامج HPLC.
3. في علامة التبويب "المعلمات العامة"، حدد وضع التسريب كروماتوغرافيا السائلة، وعرض ذروة LC المتوقع (30 ثانية)، وحالة الشحن الافتراضية (2).
4. انتقل إلى علامة التبويب Scan Parameters وأضف عمليات الفحص والمرشحات التالية بالترتيب المذكور: MS OT و MIPS و Intensity و Charge State و Dynamic Exclusion و ddMS2 OT HCD.
   قد تختلف إعدادات MS وDDA المثلى باختلاف مطياف الكتلة المحدد المستخدم بالإضافة إلى نوع العينة وبالتالي يجب تكييفها.
5. تحضير العينات عن طريق إذابة 200-400 نانوغرام من عينة الببتيدات في حجم محدد قدره 0.1٪ TFA في مداخل قارورة زجاجية طيفية كتلية خاملة. إذا كان تحديد التركيز غير قابل للتطبيق بسبب انخفاض كمية العينة ، فتحقق من تحميل العينة المتطابق من خلال مقارنة إجمالي التيار الأيوني (TIC).
   NOTE: للقيام بذلك، افتح الملف الناتج لقياس الطيف الكتلي في برنامج مناسب، على سبيل المثال، FreeStyle، وتحقق من الكروماتوجرام. يجب أن تكون الشدة قابلة للمقارنة لجميع العينات. يظهر TIC تمثيلي في الشكل 1.
6. تحليل البيانات الأولية التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج proteomic مناسب، على سبيل المثال، MaxQuant أو Progenesis QI للبروتينات، أو Proteome Discoverer، وإجراء تحليل البيانات الإحصائية بناء على سؤال البحث.

3. تحليل البيانات الأولية البروتينية باستخدام MaxQuant

1. قم بتحميل الملفات الأولية في برنامج MaxQuant في رأس البيانات الأولية بالنقر فوق تحميل.
2. قم بتعيين أسماء العينات بالنقر فوق تعيين التجربة.
3. تحديد المعلمات الخاصة بالمجموعة. أولا ، أضف التعديلات. نظرا لمعالجة العينة ، اختر إزالة الإزالة (NQ) والأكسدة (M) و Carbamidomethylation (N-term) كتعديلات متغيرة ، وأضف Carbamidomethylation (C) كتعديل ثابت.
4. اختر التربسين كإنزيم هضم في علامة التبويب "الهضم".
5. أضف خيار القياس الكمي الخالي من الملصقات LFQ في علامة التبويب Label Free Quantification. إذا كان سيتم معالجة أكثر من 10 ملفات ، فاختر خيار Fast LFQ لتقصير وقت المعالجة. أضف خيار iBAQ كمقياس لقياس البروتين.
6. تأكد من بقاء جميع المعلمات الأخرى الخاصة بالمجموعة في إعدادات المصنع.
7. انتقل إلى علامة التبويب المعلمات العامة وأضف ملف FASTA المشتق من uniprot.org في علامة التبويب Sequences. قم بتعديل قاعدة المعرف وفقا لذلك وأضف معرف التصنيف ، في هذه الحالة ، 9606 ل homo sapiens.
لقياس البروتين الكمي ، اختر الببتيدات الفريدة والشفاقة.
9. تأكد من بقاء جميع المعلمات العامة الأخرى في إعدادات المصنع.
10. انقر فوق ابدأ واسترجع proteingroups.txt الإخراج بعد تحليل MaxQuant لمزيد من التحليل في Perseus.

النتائج

الشكل 1: إجمالي التيار الأيوني (TIC) لقياس DDA لمدة 120 دقيقة. يظهر الرسم الكروماتوغرامي الوفرة النسبية للأيونات المقابلة للببتيدات المملوءة خلال النطاق الزمني ل...

المواد

<فئة الشكل = نمط الجدول = 'العرض: 686 نقطة ؛ '><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>< col style = 'العرض: 31.63٪ ؛ '>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td style = 'border-top-style: none ؛ الارتفاع: 15.5pt ؛ العرض: 206pt ؛ '> 1،4-dithiothreitol AppliChem A1101 Acetonitrile Merck 1.00029.2500 bikranium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Formic acidSigma-Aldrich 56302 Iodoacetamide AppliChem A1666,0100 Micro Tube 500Carl Zeiss415190-9221-000 Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass SpectrometerThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFADBMBHQ PALM-MicroBeamZeiss494800-0014-000 trifluoroacetic acidMerck 91707 Trypsin sequenceing gradeServa37283.01 Ultimate 3000 RSLC nano LC systemThermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANO name of softwareWeblink/CompanyVersion FreeStyleThermo Fisher Scientific1.6 MaxQuanthttps://www.maxquant.org/1.6.17.0 <td style='border-top-style:none;height:15.5pt;width:206pt;'>PALMRoboZeiss4.6 pro Perseushttps://www.maxquant.org/perseus/1.6.15.0 Skylinehttps://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view20.2.0.343 XCaliburThermo Fisher Scientific4.3