التصوير القائم على الكيمياء الخلوية المناعية لتصور هجرة خلايا الورم الدبقي لدى الأطفال

الملخص

المصدر: Pericoli, G. et . al., فحوصات الكيمياء المناعية للخلايا الحية ثلاثية الأبعاد للورم الدبقي المنتشر في خط الوسط لدى الأطفال. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو تصوير الخلايا الحية لمراقبة هجرة خلايا الورم الدبقي المنتشرة في خط الوسط لدى الأطفال باستخدام الملصقات الكيميائية المناعية مع الأجسام المضادة ل CD44.

البروتوكول

1. توليد كرويات الورم ذات الحجم المتكرر

1. اجمع الورم الدبقي المنتشر في خط الوسط (DMG) H3K27M-metaant neuroments (NS) وأجهزة الطرد المركزي عند 170 × g لمدة 10 دقائق (دقيقة) في درجة حرارة الغرفة (RT).
2. 7g³ جدول المواد < span style = 'font-family: Roboto ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس. المساحة البيضاء: التفاف مسبق ؛ >). استخدم كثافة خلية مناسبة للحصول على NS فردي بقطر ~ 300 ميكرومتر ، بعد 4 أيام من بذر الخلايا (250-500 خلية / بئر لخلايا الورم الدبقي شديد العدوانية).
3. 2. تحضير كاشف وضع العلامات على الأجسام المضادة (ALR)/مركب الجسم المضاد والإعداد لمقايسة الهجرة style='هامش أسفل:0;margin-top:0;padding-inline-start:48px;'>
4. ضع في اعتبارك عدد الآبار لتحليل وحساب الحجم المطلوب لكل كاشف. يتضمن أيضا الآبار اللازمة للضوابط السلبية. تحقق من NS بصريا باستخدام مجهر مقلوب قبل البدء.
5. NOTE: NOTE: NOTE:₂3. إعداد أداة تحليل الخلية الحية للحصول على الصور
   1. امسح اللوحات باستخدام أداة تحليل الخلايا الحية (للحصول على المواصفات ، انظر جدول المواد < span style = 'font-family: Roboto ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس ؛ المساحة البيضاء: التفاف مسبق ؛'>) مع فترات المسح الضوئي التي تبدأ من النقطة الزمنية صفر (t0) لمقايسات الغزو والترحيل التي تم إعدادها ، على التوالي ، بعد الخطوة 2.14. و 3.10. حتى 96 ساعة.
      NOTE: الجدول الزمني للحصول عليها. انقر فوق + tab وحدد الخيار Scan on Schedule. style='لون الخلفية:شفاف;اللون:#1a202c;font-family:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:عادي;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='1'> إنشاء أو استعادة الوعاء < span style = 'font-family: Roboto ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس ؛ المساحة البيضاء: التفاف مسبق ؛ > ، انقر فوق الخيار New. style='لون الخلفية:شفاف;اللون:#1a202c;font-family:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:عادي;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='1'>Spheroid scan type, 4x objective, Phase + Brightfield and Green قنوات صورة لمقايسة الغزو. حدد dillution Cloning scan type, 4x objective and Phase and Green for asise migration. style='لون الخلفية:شفاف;اللون:#1a202c;font-family:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:عادي;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='1'>Add to Schedule and start scan.

المواد

< فئة الشكل = نمط الجدول = 'العرض: 563 نقطة ؛ '><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'> < col style = 'width: 19.01٪ ؛ '>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td style = 'height: 26.0pt ؛ width: 107pt ؛ '>96 Well TC-Processing Microplates < td style = 'width: 122pt ؛ '>Corning < td style = 'width: 102pt ؛ '> 3595 < td style = 'width: 232pt ؛ '> حجم 96 آبار ، لوح بوليسترين ، قاع مسطح< td style='height:: 14.5pt;width:107pt;'>AccutaseEurocloneECB3056DSolution for neurociciation styleBurker chamberMv medicalFFL16034Cell counting chamberCD-44 (156-3C11)< td style='width:122pt;'>Cell Signaling Technology3570Mouse mAb IgG2aCorning Matrigel MatrixCorning356237Basement Membrane Matrix (BMM) ، Phenol Red-free ، LDEV-freeFabfluor-488 صبغة وضع العلامات على الأجسام المضادةIncucyte4743كاشف وضع العلامات على الأجسام المضادة (ALR): الجسم المضاد IgG2a 488 للكيمياء المناعية للخلايا الحيةIncucyte S3 و / أو SX5 أداة تحليل الخلايا الحيةSartorius-يتم استخدام أداة Incucyte S3 و / أو SX5 لمراقبة الخلايا في الوقت الفعلي ، وصحة الخلايا وقابليتها للحياة ، والهجرة والغزو ، بالإضافة إلى مجموعة واسعة من المقايسات القائمة على الخلايا المظهرية.المجهر المقلوب -أي مجهر مقلوبكاشف كاشف الخلفية الفاتحة باللون الأخضرIncucyte6500-0045كاشف قابطه الخلفية (BSR)Tumor stem cell (TSM) medium--Growth cell medium (انظر المرجع في النص للحصول على التفاصيل)