$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. جمع ورم الغدد الصم العصبية في الأمعاء الدقيقة (SBNET) وتفكك
- الخلايا< span style='background-color: transparent ؛ color: # 000000 ؛ '> الحصول على عينات SBNET للمريض بعد تأكيد أنسجة الورم من قلب علم الأمراض الجراحي.
- قم بتقطيع SBNETs إلى مكعبات بحجم 5 مم وتخزينها في 25 مل من وسط النسر المعدل (DMEM)/F12 من Dulbecco في أنبوب مخروطي الشكل لنقلها إلى المختبر.
- نقل الأورام إلى DMEM التي تحتوي على 1٪ مصل بقري جنيني أو FBS ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (قلم / Streptomyc) ، و 1٪ جلوتامين (وسط غسيل) ، واحتضانها في وسط الغسيل هذا لمدة 15 دقيقة.
- انقل الأورام إلى طبق جديد وفرمها إلى قطع يقل قطرها عن 1 مم باستخدام مقص منحني معقم.
- انقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب جديد سعة 50 مل يحتوي على 25 مل من Wash Medium.
- الطرد المركزي العينة عند 500 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الكريات في 10 مل من Wash Medium الذي يحتوي على كولاجيناز (100 U/mL) و DNase (0.1 ملغ/مل).
- السماح بهضم الأورام المفرومة في حاضنة 37 درجة مئوية مع اهتزاز بطيء (50 دورة في الدقيقة) لمدة 1.5 ساعة.
2. ثقافة SBNETs ككرويات ورم في المصفوفة الخلوية الإضافية (ECM)
- بعد اكتمال الهضم (الخطوة 1.8) ، جهاز الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 15 مل من وسط الغسيل.
- ضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر فوق أنبوب جديد سعة 50 مل وانقل 10 مل من وسيط الغسيل فوق مصفاة الخلية. قم بتدوير وسيط الغسيل لتغطية جانب الأنبوب البلاستيكي لمنع خلايا NET من الالتصاق بجانب الأنبوب البلاستيكي.
- قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية.
- الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية، تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من وسط الغسيل (الحجم الإجمالي ~ 250 ميكرولتر) ، وضعها على الجليد.
- نقل 5 ميكرولتر من الخلايا إلى 500 ميكرولتر من وسط الغسيل (1/100 عامل تخفيف). استخدم الخلايا المخففة لعد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم للحصول على عدد الخلايا لكل مليلتر. اضرب في 100 لتصحيح عامل التخفيف.
- اضرب عدد الخلايا لكل مل تم الحصول عليها في الخطوة 2.5 في الحجم الكلي للخلايا المعلقة التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.4 (~ 250 ميكرولتر).
- جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية، وتخلص من المادة الطافية، وأعد تعليق الخلايا في ECM السائل (1 × 106 خلايا / مل)، واستمر في وضع الثلج.
- نقل 5-20 ميكرولتر من الكرويات SBNET في ECM إلى لوحة 96 بئرا والسماح ل ECM السائل بالتصلب عن طريق وضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- أضف 200 ميكرولتر من وسط زراعة SBNET (DMEM/F12 + 10٪ FBS + 1٪ PEN/STREP + 1٪ جلوتامين + 10 مللي نيكوتيناميد + 10 ميكروغرام/مل أنسولين) إلى كل بئر من اللوحة المكونة من 96 بئرا التي تحتوي على سكرويدات SBNET في ECM.
- بدلا من ذلك، زراعة عضيات SBNET في وسائط الخلايا الجذعية المشابهة لما تم وصفه سابقا لزراعة الكبد البشري أو العضيات البنكرياسية والمدرجة في جدول المواد.
- قم بتغيير الوسائط كل 5-7 أيام.
3. توصيف الكرويات SBNETS عن طريق التألق
- المناعينقل العضيات المزروعة في ECM إلى أنبوب سعة 1.5 مل باستخدام ماصة P1000.
الطرد المركزي عند 1,500 × جم لمدة 1 دقيقة وإزالة المادة الطافية.- اغسل المزرعة العضوية بإضافة 1 مل من محلول ملحي عازل للفوسفات أو PBS، واخلط، وجهاز الطرد المركزي عند 1,500 × جم لمدة 1 دقيقة وقم بإزالة المادة الطافية.
- قم بإصلاح العضيات بإضافة 500 ميكرولتر من 4٪ paraformaldehyde واحتضانها لمدة 15 دقيقة.
- اغسل المزرعة مرتين باستخدام 1 مل من PBS.
- نفخ الثقافة عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من PBS + 3٪ ألبومين مصل بقري أو BSA + 0.1٪ تريتون × 100 لمدة 5 دقائق.
- ثم اغسل ثلاث مرات باستخدام 1 مل من PBS + 3٪ BSA.
- احتضن لمدة ساعة واحدة مع الأجسام المضادة الأولية ضد synaptophysin (SYP) عند تخفيف 1/600 أو الكروموجرانين A (CgA) ومستقبلات السوماتوستاتين 2 (SSTR2) عند تخفيف 1/400 في عازلة الأجسام المضادة (2.5٪ ألبومين مصل بقري ، 0.1٪ أزيد الصوديوم ، 25 ملي مولار تريس درجة الحموضة 7.4 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم).
ملاحظة: استخدم 300 ميكرولتر أو أكثر من محلول الأجسام المضادة لكل أنبوب. - اغسل ثلاث مرات باستخدام 1 مل من PBS + 3٪ BSA.
- احتضن مع الأجسام المضادة الثانوية المقترنة ب FITC عند تخفيف 1/500 في عازلة الجسم المضاد لمدة 1 ساعة. استخدم 300 ميكرولتر أو أكثر من محلول الأجسام المضادة لكل أنبوب.
- اغسل 3 مرات باستخدام 1 مل من PBS + 3٪ BSA. تأكد من الشفط والتخلص من كل المادة الطافية
- أضف 5 ميكرولتر من وسط التركيب الذي يحتوي على البقعة النووية DAPI.
- استخدم ماصة P20 لنقل 5 ميكرولتر من الكرات SBNET من الخطوة 4.12 إلى شريحة زجاجية وإغلاقها بقلة غطاء.
- التقط صورا باستخدام مجهر فلوري باستخدام أهداف 10x أو 20x أو 40x.