قياس معدل استهلاك الأكسجين في شرائح دماغ الفأر الحادة

الملخص

المصدر: Zhi، L. et al.، قياس معدل استهلاك الأكسجين في الشرائح العقدية الحادة من الفئران البالغة. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح هذا الفيديو كيفية قياس معدل استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا (OCR) في شرائح الدماغ المخططة للفأر. يوضح بالتفصيل خطوات تحضير لوحة المناديل وخرطوشة المستشعر ، وتحميلها في محلل التدفق ، ويشرح العمليات الخلوية الكامنة وراء أنماط التعرف الضوئي على الحروف.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية للحيوانات المناسبة.

1. مستشعرات خرطوشة الترطيب (1 يوم قبل الفحص)

1. افتح مجموعة مقايسة التدفق خارج الخلية (انظر جدول المواد) وقم بإزالة كل من خرطوشة المستشعر (الأخضر) ولوحة المرافق (واضحة; الشكل 1 أ). ضع خرطوشة المستشعر جانبا (المستشعرات لأعلى) ولا تلمس المستشعرات.
2. أضف 600 ميكرولتر من محلول العيار (الرقم الهيدروجيني 7.4) إلى كل بئر من لوحة المرافق. ضع خرطوشة المستشعر أعلى لوحة المرافق واغمر المستشعرات في محلول العيار. تأكد من محاذاة الشق الثلاثي للأداة المساعدة ولوحة خرطوشة المستشعر بشكل صحيح (الشكل 1 ب).
3. أغلق مجموعة مقايسة التدفق خارج الخلية بغشاء مانع للتسرب لمنع تبخر محلول العيار، ثم ضعه في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية غير مكملة بثاني أكسيد الكربون₂ أو الأكسجين طوال الليل.

2. جهز صفيحة المناديل (في يوم الفحص)

1. افتح الصفيحة الدقيقة لالتقاط الجزيرة وأخرج لوحة الجزيرة لجلوس الأنسجة.
2. قم بتسخين حجم مناسب (625 ميكرولتر لكل بئر) من السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي المعدل مسبقا بالأكسجين (ACSF ، التركيب 140 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.5 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.4 ملي كلوريد_{الملليوم 2} ، 1.3 ملي مولار MgSO₄ ، 0.3 ملي هيلو هيلو_{أمبير 2}بئر₄ ، 25 ملي جلوكوز ، 10 ملي هيبس ، درجة الحموضة 7.2) عازلة إلى 37 درجة مئوية في أنبوب سعة 50 مل. ثم أضف BSA إلى التركيز النهائي البالغ 4 مجم / مل لتحضير المخزن المؤقت للتنفس. بشكل عام ، 50 مل تكفي لطبق واحد.
3. أضف 625 ميكرولتر من عازلة التنفس (عازلة ACSF مؤكسجة مسبقا مع 25 ملي مولار جلوكوز و 4 ملغ/مل BSA) إلى كل بئر من لوحة الجزيرة بعناية وتجنب اهتزاز اللوحة. تأكد من عدم وجود قطرات متبقية أعلى خرطوشة المستشعر وعدم وجود فقاعات هواء في المخزن المؤقت لكل بئر.

3. تحضير الشريحة المخططة الحادة ووضع

1. الشريحة المقطوعة اقطع رأس الفأر بعد خلع عنق الرحم وقم بتشريح الدماغ على الفور في 10 مل من محلول القطع الأكسجين المثلج (125 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.5 ملي كلوريد الصوديوم ، 26 ملي هيدروكسيوم₃ ، 3.7 ملي مولار MgSO₄ ، 0.3 ملي مولار KH₂PO₄ ، 10 ملي مولار جلوكوز ، درجة الحموضة 7.4).
2. section striatal striatal with ebratome follow instruction من الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) بسمك 150 ميكرومتر في محلول القطع المثلج والأكسجين المسبق.
3. استرجع الشرائح في 50 مل من ACSF المؤكسج (125 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.5 ملي كلوريد الكودميد ، 26 ملي NaHCO₃ ، 2.4 ملي كلوريد_{الكالسيوم 2} ، 1.3 ملي مولار MgSO₄ ، 0.3 ملي كيلو هيلو₂PO₄ ، 10 ملي جلوكوز ، 2 ملي مولار HEPES ، درجة الحموضة 7.4) واحتفظ بها في المحلول لمدة تصل إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
4. بعد التعافي، انقل الشرائح إلى طبق بتري مقاس 35 مم × 10 مم مع 5 مل من المخزن المؤقت للتنفس.
5. استخدم ثقب خزعة من الفولاذ المقاوم للصدأ (على سبيل المثال، قطر 1.5 مم) لإنشاء قطعة دائرية من الأنسجة في المنطقة المرغوبة من الدماغ المقطع. احتفظ بالشريحة في المخزن المؤقت مع الضغط برفق باستخدام الثقب. تأكد من دفع الثقب لأسفل بقوة كافية لقطع الأنسجة. قم بإزالة باقي الأنسجة ، وارفع الثقب بعيدا ، وقم بإزالة القطعة الدائرية من الأنسجة في المخزن المؤقت.
6. قم بقص نهاية طرف الماصة سعة 1 مل لعمل ثقب بقطر 1.5-2.0 مم واستخدمه لتثبيت الشريحة المثقوبة ونقلها إلى أعلى شاشة الالتقاط. قم بشفط قطعة واحدة من أنسجة المخ المثقوبة وضع الأنسجة بعناية على الجانب الشبكي لشاشة الالتقاط (الشكل 2 أ). ستكون شاشة الالتقاط عبارة عن قطعة دائرية من البلاستيك مع شبكة متصلة بجانب واحد.
   ملاحظة: يتم تضمين شاشات الالتقاط في حزمة microplate (انظر جدول المواد).
7. استخدم منديلا ورقيا برفق لتجفيف شاشة الالتقاط لفترة وجيزة. مع إزالة الرطوبة ، تصبح الأنسجة لزجة ، مما يسمح للشريحة بالالتصاق بمركز الشبكة. لا تجفف الشريحة كثيرا ، لأنها ستتلف بخلاف ذلك.
8. أمسك جانب شريحة شاشة الالتقاط لأسفل باستخدام ملاقط وضعها في أحد آبار لوحة الجزيرة الحاضنة (الشكل 2 ب). احرص على عدم إسقاط الشريحة. إذا كان الأمر كذلك ، فأخرج الشاشة وضع شريحة جديدة عليها.
   NOTE: لا تضع شرائح الدماغ في بئري تصحيح الخلفية (A1 و D6) في لوحة الجزيرة.
9. احتضان لوحة الجزيرة عند 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح بتوازن درجة الحرارة ودرجة الحموضة قبل إجراء الفحص.

4. تحميل الخراطيش بالمركبات المرغوبة

1. تمييع المركبات المرغوبة في ACSF المعدل (37 °C) إلى تركيز المخزون النهائي 10x و 11x و 12x و 13x من تركيز العمل للمنافذ A إلى D ، على التوالي ، واضبطها على الرقم الهيدروجيني 7.4. سيقوم الاختبار بإدارة المركبات بالترتيب من الميناء A إلى D. في هذه التجربة ، تم استخدام المحاليل التالية ، مع التركيز العملي الخاص بها المذكور قبلها: 10 ملي مولار بيروفات (المنفذ A) ، 20 ميكرومتر أوليغومايسين (المنفذ B) ، 10 ميكرومتر أو تركيزات أخرى من سيانيد الكربونيل 4- (ثلاثي فلوروميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP) (المنفذ C) ، و 20 ميكرومتر أنتيمايسين A (المنفذ D).
2. قم بتحميل 75 ميكرولتر من المركبات المخففة برفق في منافذ الحقن المناسبة لخرطوشة المستشعر. ضع الأطراف في منتصف الطريق في منافذ الحقن بزاوية 45 درجة مع وضع الطرف على جدار منفذ الحقن. لا ينبغي إدخال الأطراف بالكامل في الجزء السفلي من منافذ الحقن لأن ذلك قد يتسبب في تسرب المركب عبر المنفذ.
3. اسحب النصائح من المنافذ بعناية لتجنب تكوين فقاعات هواء. لا تنقر على أي جزء من الخرطوشة لتجنب تخفيف فقاعات الهواء.
4. افحص بصريا منافذ الحقن للتحميل المتساوي. تأكد من وجود كل السائل في المنفذ وعدم وجود قطرات متبقية أعلى الخرطوشة.
5. ضع خرطوشة المستشعر على لوحة المرافق وضعها في حاضنة (غير CO₂) لمدة 30 دقيقة للسماح لها بالتسخين حتى 37 درجة مئوية مرة أخرى. تعامل بعناية عن طريق التمسك بلوحة المرافق فقط. تحرك بأقل قدر ممكن.

5. معايرة وإجراء الفحص

1. قم بتحميل قالب الفحص في البرنامج. اضغط على زر START الأخضر.
2. تأكد من تحميل البروتوكول الصحيح. يحتوي البروتوكول على مجموعة من 3 دقائق من المزيج ، و 3 دقائق من الانتظار ، و 2 دقيقة من تسلسلات القياس (تشكل هذه الخطوات الثلاث قياسا واحدا). قم بتغيير مسافة رأس المسبار من 26,600 إلى 27,800 في إعدادات الأجهزة ضمن إعدادات الجهاز. ليست هناك حاجة لتغيير رأس المسبار لمحلل XFe24. اضغط على START.
3. قم بتحميل خرطوشة المستشعر على لوحة المرافق في درج العدادات. يذهب الشق في الزاوية اليسرى الأمامية. تأكد من أن اللوحة تجلس بشكل صحيح ومسطحة. قم بتحميل خرطوشة المستشعر المملوءة بالدواء في المحلل للمعايرة.
4. اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة لمعايرة المستشعرات وموازنتها. يستغرق هذا حوالي 30 دقيقة.
5. بمجرد الانتهاء من خطوة المعايرة، قم بإزالة لوحة المعايرة واستبدلها بلوحة الجزيرة (التي تحتوي على الشبكة وشرائح الأنسجة).
6. قياس استهلاك الأكسجين في كل بئر من اللوحة باستخدام بروتوكولات الفحص. يحتوي البروتوكول على مزيج من 3 دقائق من المزيج ، و 3 دقائق من الانتظار ، و 2 دقيقة من تسلسلات القياس (تشكل هذه الخطوات الثلاث قياسا واحدا) ، وعند هذه النقطة يتم حساب معدل استهلاك الأكسجين (OCR).
7. بالنسبة للتجربة بأكملها، قم بتضمين 4x قياسات التعرف الضوئي على الحروف لإنشاء خط أساس، متبوعا بحقن المنفذ A (البيروفات) بقياسات 4x، ثم حقن المنفذ B (oligomycin) بقياسات 8x، ثم حقن المنفذ C (FCCP) بقياسات 5x، وأخيرا، حقن المنفذ D (antimycin A) بقياسات 6x.
   NOTE: يتم تحديد هذا العدد من القياسات بعد كل حقن مركب اعتمادا على وقت وصول القياس إلى الهضبة.
8. تحليل بيانات قياس التعرف الضوئي على الحروف وبيانات كفاءة الاقتران.

النتائج

الشكل 1: صور توضح محلل التدفق خارج الخلية ، ومستشعرات خرطوشة الهيدرات واللوحة. ( A) خرطوشة المستشعر الموجودة فوق لوحة المعايرة (لوحة المرافق). (B) منظر جانبي للوحة المرافق ولوحة خرطوشة المستشعر. يجب محاذاة الشق الثلاثي ل...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = 'collapse border: collapse ؛ font-family: Calibri ؛ حجم الخط: 11pt ؛ تخطيط الجدول: fixed ؛ 'cellpacing = '0' cellpadding = '0' dir = 'ltr' border = '1' data-sheets-root = '1' data-sheets-baot = '1'>style = 'width: 25٪;' width = '459'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Accumet AB150 مقياس الرقم الهيدروجيني < td style = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> Thermo Fisher Scientific < td style = 'overflow: مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> 13-636-AB150 < td style = 'overflow: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> لقياس الأس الهيدروجيني < td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: top ؛ '>Antimycin A من Streptomyces sp.<نمط td = 'overflow: مخفي ؛ حشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ vertical-align: top ؛ '>SIGMAA8674 < td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: top ؛ white-space: normal ؛ word-wrap: break-word ؛ wrap-strategy: 4 ؛ '>To hibit complex III of mitochondria bovine serum albumin (BSA)SIGMAA6003to make modified artificial spinal fluid (BSA-ACSF)Carbonyl cyanide 4-( ثلاثي فلوروميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP) < نمط TD = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛'>SIGMA< نمط td = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛'>C2920 < td style = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ '> لفصل تنفس الميتوكوندريا < نمط tr = 'الارتفاع: 19 بكسل ؛ '>< td style = 'overflow: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛>D-GlucoseSIGMAG8270to make artificial spinal (ACSF)DMSOSIGMAD8418To dissovle compoundsHEPESSIGMAH3375to make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)desert-homo-mal-hybrid non-carbon incubatorFisher علمي 11-683-230D < td style = 'overflow: hidden؛ padding: 0px 3px؛ vertical-align: top؛ white-space: normal؛ word-wrap: break-word؛ wrap-strategy: 4 ؛ '> لترطيب الألواح عند 37 درجة مئوية oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>SIGMAO4876to hibit inthase ATP mitochondriaparafilmSIGMA-ALDRICH sealing filmSeahorse XF Caliberrant Solution 500 mLSeahorse Bioscience103681-100Solution for base-offionionSeahorse XF Extra-Cellular Flux AnalyzerSeahorse Bioscience المعدات المستخدمة لتحليل معدل استهلاك الأكسجين, الجيل القديمSeahorse XFe24 محلل التدفق خارج الخلية < td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: top ؛ '>Seahorse Bioscience < td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: top ؛ '> < td style = 'overflow: hidden ؛ boardding: 0px 3px ؛ vertical-align: top ؛ white-space: normal ؛ word-wrap: break-word ؛ wrap-strategy: 4 ؛ '> المعدات المستخدمة لتحليل معدل استهلاك الأكسجين ، الجيل الجديد < td style = 'overflow: hidden; الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ ' >Seahorse XF24 FluxPaksSeahorse Bioscience101174-100 حزمة من خراطيش مستشعر محلل التدفق ولوحات زراعة الأنسجة وشاشات الالتقاط ومحلول العيار ولوحات المعايرة. طقم الفحص.Sodium pyruvate SIGMAP2256to prevent أي قيود تحد من الركيزة لإمدادات الركيزةStainless Steel Biopsy ipressesMiltex device used to punch slicesطبق زراعة الخلايا المعقم ، 35 × 10 مم < نمط td = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> Eppendrof< td style = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>30700102 < نمط td = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> تستخدم لكمة الشريحة VibratomeLeicaVT1200To slice tissue <tr style='height:19px;'>bath waterThermo-Scientific Precision282-115to heat buffer and solutions