تطوير نموذج الضغط عبر الصمعي باستخدام نظام مستقل عبر الصفائح

الملخص

المصدر: Sharma، T. P.، وآخرون، نموذج النظام المستقل عبر الصمعي لتعديل الضغط داخل العين وداخل الجمجمة في الأجزاء الخلفية من المتبرع البشري. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو إجراء إعداد العين البشرية لدراسة تأثيرات الضغط العرضي على إشارات الخلايا العقدية الشبكية عن طريق محاكاة الضغوط داخل العين وداخل الجمجمة في نظام مستقل عبر الصفائح.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

1. تحضير وتعقيم المعدات واللوازم

1. راجع جدول المواد للحصول على قائمة كاملة بالإمدادات المطلوبة بالإضافة إلى أرقام الموردين والكتالوج.
2. قبل الاستخدام ، قم بتعقيم جميع المعدات والأدوات عن طريق التعقيم أو استخدام أمبولات أكسيد الإيثيلين.

2. تحضير وسط التروية

1. أضف 1٪ بنسلين ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل بنسلين ، 10,000 ميكروغرام / مل ستربتومايسين في 0.85٪ كلوريد الصوديوم) و 1٪ ل-جلوتامين (200 مل) إلى 1,000 مل ارتفاع الجلوكوز وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM).
2. تعقيم وسط التروية بالمرور عبر مرشح 0.22 ميكرومتر.

3. إعداد النظام المستقل عبر الصمعي (TAS)

1. إعداد محاقن التدفق الداخلي (خزانات ضغط العين (IOP) والضغط داخل الجمجمة (ICP).
   1. أضف 30 مل من وسط التروية (القسم 2) إلى حقنة 30 مل. قم بتوصيل محبس 3 اتجاهات بحقنة 30 مل. قم بتوصيل مرشح محب للماء 0.22 ميكرومتر بمحبس ثلاثي الاتجاهات. قم بتوصيل محول كعب Luer 15 G بالمرشح المحب للماء 0.22 ميكرومتر.
   2. قم بإزالة فقاعات الهواء من إعداد المحقنة. قم بتوصيل الأنبوب بمحول كعب Luer 15 G. أغلق المنفذ الجانبي للمحبس بغطاء قفل عالمي غير مهواة. كرر ما مجموعه إعدادين.
   3. قم بتسمية حقنة واحدة على أنها ضغط داخل الجمجمة للقناة 1 (CH1 ICP) والحقنة الأخرى كضغط داخل العين للقناة 2 (CH2 IOP).
2. إعداد محاقن التدفق الخارجي (خزانات IOP و ICP).
   1. قم بتوصيل محبس ثلاثي الاتجاهات بحقنة سعة 30 مل. قم بتوصيل محول كعب Luer سعة 15 جيجا بمحبس ثلاثي الاتجاهات. قم بتوصيل الأنبوب بمحول كعب Luer 15 G.
   2. أغلق المنفذ الجانبي للمحبس بغطاء قفل عالمي غير مهواة. كرر ما مجموعه إعدادين. قم بتسمية حقنة واحدة على أنها CH1 ICP والحقنة الأخرى على أنها CH2 IOP.

4. تحضير الكرة الأرضية للعين البشرية

ملاحظة: إذا تم تلقي عيون كاملة ، فاتبع الإجراء أدناه لفصل الجزء الأمامي عن الجزء الخلفي من العين. إذا تم تلقي العينين إلى قسمين ، فابدأ في الخطوة 4.4.

1. ضع عين كاملة في محلول بوفيدون اليود لمدة دقيقتين.
2. اشطف العين بمحلول معقم مخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة بوفيدون اليود. كرر مرتين.
3. قم بإزالة adnexa من كرة العين بأكملها باستخدام ملقط ومقص. قم بتقسيم العين عند خط الاستواء لفصل الأجزاء الأمامية والخلفية للعين.
4. قم بإزالة غمد العصب البصري. إزالة الخلط الزجاجي من الجزء الخلفي.
5. تقليم الصلبة الإضافية من الجزء الخلفي ، إذا لزم الأمر ، لضمان ملاءمة جيدة للقبة المستديرة لغرفة IOP (السفلية). باستخدام الملقط ، تأكد من انتشار شبكية العين بالتساوي على الجزء الخلفي من الجزء.
6. إعداد غرفة IOP (السفلية)
   1. ضع الجزء الخلفي البشري في غرفة IOP (السفلية) من TAS فوق القبة المستديرة مع مواجهة العصب البصري للأعلى.
   2. أغلق الجزء الخلفي باستخدام الحلقة O المصنوعة من راتنجات الايبوكسي بأربعة براغي ، مما يضمن إحكام إحكام.
   3. أدخل الأنبوب في منفذي الإدخال والإخراج في غرفة IOP (السفلية). يتم إدخال حقنة تدفق IOP مع أنبوب يحتوي على وسيط في منفذ IN ويتم إدخال حقنة تدفق IOP الفارغة مع الأنابيب في منفذ OUT.
   4. استخدم طريقة الدفع / السحب لغرس وسط التروية ببطء في منفذ التدفق لملء كوب العين الخلفي مع سحب وسط التروية ببطء من خلال حقنة التدفق لإزالة أي فقاعات هواء من الخطوط. توقف عن نقع الوسط بمجرد خلو كل من أنابيب IN و OUT من فقاعات الهواء.
   5. قفل محبس في وضع إيقاف التشغيل. قم بإزالة المحقنة سعة 30 مل من مجموعة مرشح منفذ IOP IN وأعد تعبئتها ب 30 مل من الوسط. ثم استبدل المحقنة بمجموعة الفلتر.
7. إعداد غرفة برنامج المقارنات الدولية (العلوي)
   1. ضع حجرة/غطاء برنامج المقارنات الدولية (العلوي) على الجزء الخلفي من الجزء الخلفي. تأكد من أن العصب البصري داخل الغرفة العلوية. أغلق الغرفة العلوية بأربعة براغي.
   2. أدخل الأنبوب في منافذ IN و OUT لغرفة ICP (العلوية). يتم إدخال حقنة التدفق المقارنات الدولية مع أنبوب يحتوي على وسيط في منفذ IN ويتم إدخال حقنة تدفق ICP الفارغة مع الأنبوب في منفذ OUT.
   3. قم بغرس الوسيط برفق وببطء في منفذ IN لملء حجرة ICP وإزالة فقاعات الهواء من الخطوط باستخدام طريقة الدفع / السحب. توقف عن غرس الوسط بمجرد خلو غرفة برنامج المقارنات الدولية وكل من أنابيب IN و OUT من فقاعات الهواء.
   4. قفل محبس في وضع إيقاف التشغيل. قم بإزالة المحقنة سعة 30 مل من مجموعة مرشح ICP في المنفذ وأعد تعبئتها ب 30 مل من الوسط. ثم استبدل المحقنة بمجموعة الفلتر.

المواد

< فئة الشكل = نمط "الجدول" = 'العرض: 696pt;'>td style='width:174pt;'> < td style='الارتفاع:62.0pt;العرض:174pt;' >114 Buna-N O-Ring ، مقياس التحمل 70A ، أسود ، 5/8 "ID ، 13/16" OD ، 3/32 "العرض (حزمة من 100) < td style = 'العرض: 174pt ؛'>Amazon < td style = 'width: 174pt ؛ '>Vitality Medical < td style = 'width: 174pt ؛ '>302832 < td style = 'width: 174pt ؛ '> < td style = 'height: 46.5pt; العرض: 174pt ؛ ' >3-Way Stopcock ، 2 أقفال Luer أنثوية ، قفل لور ذكر دوار ، غطاء تنفيس النمط < td style = 'العرض: 174pt ؛ '>QOSINA < td style = 'width: 174pt ؛ '> 2C6201 < td style = 'width: 174pt ؛ '> < td style = 'الارتفاع: 46.5pt ؛ العرض: 174pt ؛ '>4-40 × 1/2 PH PAN MS SS / CHROME & مفك براغي فيليبس بالحجم المناسب < td style = 'العرض: 174pt ؛ '>Brikksen الفولاذ المقاوم للصدأ Fastners< td style = 'width: 174pt ؛ '>PPMSSSCH4C.5< td style='height:: 31.0pt;width:174pt;'>ANPROLENE 16 LARGE AMPULE< نمط TD = 'العرض: 174pt;'>Sigma-Aldrich< td style='العرض:174pt;'>11254-20< td style='width:174pt;'> < td style='width:174pt;'> < td style='height:: 31.0pt ؛ العرض : 174pt ؛ '> Fisherbrand 4 أوقية حاويات العينة < td style = 'العرض: 174pt ؛ '>Fisher Scientific < td style = 'width: 174pt ؛ '> 16-320-730 < td style = 'width: 174pt ؛ '> < td style = 'height: 31.0pt ؛ width: 174pt ؛ '> Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches< td style = 'width: 174pt ؛ '>Fisher Scientific < td style = 'width: 174pt ؛ '>01-812-54 < td style = 'width: 174pt ؛ '> < td style = 'height: 31.0pt ؛ العرض: 174pt ؛ ' >حقائب التعقيم الفوري للختم من Fisherbrand < td style = 'العرض: 174pt ؛ '>SH3024302 < td style = 'width: 174pt ؛ '> < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 174pt ؛ '>HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution< td style = 'width: 174pt ؛ '>Fisher Scientific < td style = 'width: 174pt ؛ '>SV30010 < td style = 'width: 174pt ؛ '> < td style = 'height: 15.75pt; العرض: 174pt ؛ ' >مرشح محب للماء مع مدخل قفل لور أنثوي ، مخرج انزلاق لور ذكر ، نمط أزرق وشفاف < td = 'العرض: 174pt ؛ '> Qosina < td style = 'العرض: 174pt ؛ '> 28217 < td style = 'width: 174pt ؛ '> < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 174pt ؛ '> محولات الضغط الهيدروستاتيكي ، DELTRAN ® II ، كتالوج # DPT-200 بمعدل تدفق 3CC / HR < td style = 'العرض: 174pt ؛ '> AD Instruments < td style = 'width: 174pt ؛ '>DPT-200< td style = 'width: 174pt ؛ '> < td style='height::15.75pt ؛ العرض : 174pt ؛ '>JG15-0.5HPX 15 مقياس 0.5 بوصة NT Premium Series Depensing Tip 50 / Box < td style = 'width: 174pt ؛ '>Jenson Global< td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 174pt ؛ '>Keyence B2 ‐X710 microscope < td style = 'width: 174pt ؛ '>Keyence < td style = 'width: 174pt ؛ '>B2-X710 < td style = 'width: 174pt ؛ '> < td style='height:: 15.75pt;width:174pt;'>LabChart 8< td style='width:174pt;'>QOSINA< td style='العرض:174pt;'>NC1675398< td style='width:174pt;'> < td style='height:: 15.75pt ؛ العرض : 174pt ؛ '>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI< td style = 'width: 174pt ؛ '>ThermoFisher < td style = 'width: 174pt ؛ '>P36935 < td style = 'width: 174pt ؛ '> < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 174pt ؛ '> تركيب أنبوب الدفع للتوصيل لمحول الهواء والماء المستقيم ، 1/8 "أنبوب OD × 1/8 NPT ذكر < td style = 'العرض: 174pt ؛ '>McMAster-Carr < td style = 'width: 174pt ؛ '> 7880T113 < td style = 'width: 174pt ؛ '> < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 174pt ؛ '> تركيب أنبوب الدفع للتوصيل مع خيط عالمي للهواء والماء ، محول ، أنبوب OD × 1/8 أنبوب < نمط td = 'العرض: 174pt ؛ '>McMAster-Carr < td style = 'width: 174pt ؛ '> 51235K101 < td style = 'width: 174pt ؛ '> < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 174pt ؛ '>Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 أنابيب مرنة 500 قدم.

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
#122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" سميك, 755 مقياس التحمل 50 حزمة	Amazon	B07DRGPPZJ<
B000FMYRHK
30 مل محاقن بدون إبرة
Fisher Scientific	NC9085343
Betadine	Purdue	PUR1815001EACH
Corning 100 × 20mm tissue tissue culture المعالجة أطباق الثقافة	CLS430167-100EA
Corning L-glutamine Solution	Fisher Scientific	MT25005CI
Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4 "x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS	Med Plus Medical Supply	COV-3033-CS
Dressing Coups Delicate Delicd (sserated)	Katena	K5-4010
Dumont #5 - Fine Fallps	FST.
Eye Scissors Standard Curved	Katena	K4-7410
Falcon 150 × 15mm Plain Sterile Petrory Plate	Capitol Scientific	351058
Fisher Scientific	01-812-55
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-58
HyClone نمط النسور المعدلة من Dulbecco	Fisher Scientific
JG15-0.5HPX 15
AD instruments	LabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainer	Leica	ST5020
غطاء قفل Luer العالمي غير المنفع ، أبيض	65811
Octal Bridge Amp (Model # FE228)	AD Instruments	FE228
Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF	Fisher Scientific
Phosphate Buffered Solution (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508)	AD Instruments	PL3508
Fisher Scientific	14-171-268
Superblock T20	Fisher Scientific	PI37536
Surgical Scissors - Sharp-Blunt	FST.	14001-14
Tissue Painps Delicate 1x2 Teeth Curved	Katena	K5-4110
Translaminar Autonomous System (TAS)	مركز العلوم الصحية بجامعة شمال تكساس	N/A
USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna)	Marco Rubber & Plastics	B1000-030