الكشف عن ناقل كلوريد البوتاسيوم العصبي الفسفوري 2 عبر النشاف الغربي

الملخص

المصدر: يوشيا، س. س.، وآخرون. دراسة وظائف وأنشطة ناقل K-Cl العصبي KCC2 باستخدام النشاف الغربي. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح الفيديو خطوات الكشف عن وقياس بروتين ناقل كلوريد البوتاسيوم الفسفوري 2 (KCC2) في محللة الخلية. تتضمن هذه العملية الترسيب المناعي لعزل KCC2 الفسفوري والتلألؤ الكيميائي لتحديد كمية البروتين المعزول.

البروتوكول

1. زراعة الخلايا وتعدادها

1. قم بتسخين جميع الكواشف في حمام الخرزة (37 °C) قبل إجراء زراعة الخلايا. تحضير وسط الاستزراع ، Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ، مكمل بنسبة 10٪ مصل بقري للجنين ، و 1٪ لكل من 2 ملي مولار L-glutamine ، و 100x من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 100 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، و 100 وحدة / مل بنسلين ستربتومايسين.
2. ذوبان الجليد الصلبة الفئران KCC2b الكلى الجنينية البشرية 293 خلية (HEK293^rnKCC2b) تماما في حمام الخرزة (37 درجة مئوية). انقل الخلايا من الأنبوب المبرد إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على 5 مل من الوسائط الطازجة. قم بتدوير الخلية عند 1200 × جم لمدة 3-5 دقائق.
3. استخدم ماصة شفاطة (مثبتة بمضخة تفريغ) لشفط المادة الطافية وإضافة 10 مل من الوسائط الجديدة لإعادة تعليق الخلايا. انقل معلق الخلية إلى طبق أطباق مقاس 10 سم.
4. ضع الطبق في الحاضنة واتركه ينمو لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون. مراقبة فترة الحضانة لضمان نمو الخلايا بشكل صحي. قم بتقسيم الخلايا بشكل أكبر عندما تصل إلى أكثر من 90٪ من التقاء بعد فترة الحضانة.
5. اسحب الوسائط القديمة من طبق الخلايا واشطف الخلايا برفق باستخدام 2 مل من محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS). أضف 2 مل من التربسين واحتضنه لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
6. استخدم 2 مل من الوسائط الكاملة لغسل الخلايا الموتربكة في الطبق برفق. أضف 9 مل من الوسائط الطازجة إلى الأطباق الجديدة وأضف 1 مل من المحلول من الطبق القديم إلى كل طبق جديد. انقل أطباق الخلايا المنقسمة مرة أخرى إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة للوصول إلى التقاء ≥ 90٪.
7. عالج الخلايا إما بثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) كعنصر تحكم ، أو 8 ميكرومتر من staurosporine ، أو 0.5 ملي مولار N-ethylmaleimide (NEM) لمدة 15 دقيقة قبل حصاد الخلايا في محلول التحلل.

2. تحضير محللات الخلية وتحميل

1. العيناتاستنشاق الوسائط على طبق الثقافة (من إجراءات التعداد). ضع مزرعة الخلايا على الجليد واغسل الخلايا باستخدام PBS المثلج.
2. استنشق PBS ، ثم أضف 1.0 مل من محلول التحلل المثلج البارد الذي يحتوي على 50 ملي مولار tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، 1 ملي مولار إيثيلين جلايكول مكرر (β-أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N ′ ، N ′ - حمض التتراسيتيك (EGTA) ، 1 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، 50 ملي فلوريد الصوديوم ، 5 ملي مولار بيروفوسفات الصوديوم ، 10 ملي مولار الصوديوم β-جليسيروفوسفات ، 1 ملي مولار أورثوفانادات الصوديوم ، 1٪ (وزن / حجم) تريتون X-100 ، 0.27 م سكروز ، 1 ملي مولار بنزامين ، 0.1٪ (حجم / حجم) 2-ميركابتو إيثانول ، و 2 ملي مولار فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) إلى الطبق.
   ملاحظة: يختلف حجم المخزن المؤقت للتحلل أثناء حصاد الخلايا باختلاف أحجام الأطباق ، على سبيل المثال ، 1 مل من المخزن المؤقت للتحلل مناسب لكل 1 × 10 7 خلايا / طبق 100 مم / قارورة 150 سم² ، بينما 0.5 مل مناسب لكل 5 × 10⁶ خلايا / طبق 60 مم / قارورة 75 سم².
3. استخدم مكشطة خلية بلاستيكية باردة لكشط الخلايا من قاع الطبق، ثم استخدم ماصة برفق لنقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق موجود بالفعل على الجليد. حرك الأنبوب باستمرار لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
4. قم بتدوير الخلية المحللة في جهاز طرد مركزي بارد (4 درجات مئوية) عند 16,000 × جم لمدة 20 دقيقة، وقم بإزالة الأنبوب برفق من جهاز الطرد المركزي، وضعه على الجليد. اجمع المادة الطافية في أنبوب طازج مبرد مسبقا وتخلص من الحبيبات.
   NOTE: قد يكون من الضروري تغيير قوة الطرد المركزي والوقت حسب نوع الخلية. على الرغم من ذلك ، تشجع الإرشادات العامة على الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 20 دقيقة. ومع ذلك ، يجب تحديد ذلك لكل تجربة. على سبيل المثال ، تحتاج الخلايا الحساسة مثل الكريات البيض إلى سرعة طرد مركزي خفيفة جدا.

3. تحضير الرواسب المناعية من محللات الخلية

1. pipette 300 μl من البروتين-G-sepharose في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. قم بتدوير المحلول على 500 × جم لمدة دقيقتين وتخلص من المادة الطافية.
2. أضف 500 ميكرولتر من PBS وقم بتدوير المحلول جيدا. قم بتدوير المحلول على 500 × جم لمدة دقيقتين وتخلص من المادة الطافية. كرر هذه الخطوة.
3. امزج 1 مجم من الأجسام المضادة ل KCC2 Thr906 والأجسام المضادة ل KCC2 Thr1007 مع 200 ميكرولتر من حبات البروتين G-sepharose وتشكل الحجم إلى 500 ميكرولتر مع PBS. رج العبوة على منصة اهتزازية أو عجلة دوارة لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية. اغسل 2x باستخدام PBS.
4. قم بإجراء قياس كمية البروتين على محللات الخلية بأكملها وإضافة 1 ملغ من محللة الخلية إلى الخرز المغسول. احتضان برفق في دوار من طرف إلى طرف لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية. قم بتدوير الخرزات واغسلها 3 مرات باستخدام PBS الذي يحتوي على 150 ملي مولار من كلوريد الصوديوم (NaCl).
5. اغسل الرواسب المناعية (الخرز) 3x مع 200 ميكرولتر من PBS. أعد تعليق الحبيبات النهائية في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة 1x كبريتات الليثيوم دوديسيل (LDS).
هز الأنابيب في شاكر دوار في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق واحتضانها في كتلة تسخين عند 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

4. أداء اللطخة الغربية

1. قم بتجميع جهاز الصب وصب هلام فصل طازج بنسبة 8٪ (انظر الجدول 1 للحصول على وصفة / تحضير) لصب الجل مما يسمح بحوالي 2 سم من المساحة من أعلى زجاج الصب. أضف 200 ميكرولتر من الأيزوبروبانول المطلق إلى الإعداد واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.
   ملاحظة: تعتمد وصفة هلام بولي أكريلاميد للرحلان الكهربائي لجل دوديسيل كبريتات الصوديوم - بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) على حجم البروتين محل الاهتمام (الجدول 2). ومن ثم ، قم بتدوين حجم البروتين قبل تحديد نسبة الجل المطلوبة.
2. استخدم ماصة لإزالة الأيزوبروبانول واشطف الجل بعناية بحوالي 200 ميكرولتر من الماء المقطر. أضف جل التكديس الطازج بنسبة 6٪ (انظر الجدول 1 للوصفة / التحضير) لملء المساحة البالغة 2 سم تقريبا في إعداد الصب. ضعيها برفق في مشط البئر واتركيها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
3. قم بتثبيت الجل المصبوب في خزان الرحلان الكهربائي.
4. قم بإذابة 30.3 جم من قاعدة Tris و 144.1 جم من الجلايسين و 10 جم من SDS في 1000 مل من الماء المقطر لتحضير مخزن مؤقت للنقل 10x. قم بإعداد 1x تشغيل المخزن المؤقت عن طريق إضافة 10 مل من 10٪ SDS و 100 مل من المخزن المؤقت للنقل 10x إلى 890 مل من الماء المقطر.
5. صب 1x تشغيل المخزن المؤقت في الخزان. قم بتحميل 5 ميكرولتر من علامة الوزن الجزيئي في البئر الأول وكمية متساوية من البروتين في كل بئر من هلام SDS-PAGE (بين 18-30 ميكرولتر ، اعتمادا على حجم المشط المستخدم). املأ الآبار الفارغة ب 1x LDS وقم بتشغيل الجل لمدة 90-120 دقيقة عند 120 فولت.
6. قم بإذابة 58.2 جم من قاعدة تريس و 29.3 جم من الجلايسين في 1000 مل من الماء المقطر لتحضير مخزن مؤقت للنقل 10x. تنشيط غشاء النيتروسليلوز مع 1x نقل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 20٪ ميثانول. اشطف الجل والغشاء باستخدام مخزن النقل وانشرهما برفق على كومة التحضير.
   NOTE: ليست هناك حاجة لضبط الأس الهيدروجيني للمخازن المؤقتة قيد التشغيل والنقل حيث يجب أن تكون عند درجة الحموضة المثلى المطلوبة. أيضا ، ينصح بإعداد هذه المخازن المؤقتة وتخزينها في درجة حرارة الغرفة قبل التجربة لتوفير الوقت.
7. رتب الشطيرة المراد نقلها بهذا الترتيب: قطب سالب (إطار / نهاية أسود) - رغوة شطيرة - ورق ترشيح - جل SDS-PAGE مغسول - غشاء النيتروسليلوز المغسول - ورق الترشيح - رغوة الساندويتش - قطب موجب (إطار أحمر). قم بتكديس الساندويتش المجمع في خزان النقل وقم بتشغيله عند 90 فولت لمدة 90 دقيقة أو 30 فولت لمدة 360 دقيقة.

5. تلطيخ الأجسام المضادة وتطوير الصورة

1. قم بإزالة الغشاء واتركه يجف. سد الغشاء لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام محلول مانع مصنوع من 5٪ حليب منزوع الدسم في محلول ملحي مخزن ثلاثي يحتوي على 0.1٪ 1x Tween 20 (1x TBS-T).
2. احتضان الأغشية بتخفيف مناسب من الجسم المضاد الأولي^8،15،19 وبيتا أكتين (التحكم في التحميل) في حجب المخزن المؤقت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اغسل الغشاء في ثلاث غسلات من 1x TBS-T لمدة 5 دقائق لكل منها.
   NOTE: إن حضانة الغشاء المنفصل مع أدوات التحكم في التحميل مثل بيتا أكتين أو ألفا توبولين أو الأجسام المضادة لنازعة هيدروجين الفوسفات 3-الجلسرالديهايد هي تطبيع نتائج النشاف الغربي الأخرى أثناء القياس الكمي اللاحق. التخفيف الموصى به لكل جسم مضاد أساسي متاح في دليل الشركة المصنعة.
3. احتضان الغشاء المغسول بجسم مضاد ثانوي مخفف 5000 ضعاف في مانع المخزن المؤقت لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى ، اغسل الغشاء 3x في 1x TBS-T لمدة 5 دقائق لكل منهما.
   NOTE: يوصى بشدة برفع الجسم المضاد الثانوي ضد الأنواع التي يتم فيها رفع الجسم المضاد الأساسي. على سبيل المثال ، إذا كان الجسم المضاد الأساسي لإجمالي KCC2 هو الفأر المضاد ل KCC2 ، فيجب استخدام الجسم المضاد الثانوي لمكافحة الفأر.
4. ضع الغشاء المغسول على لوحة التصوير. امزج كميات متساوية من كل كاشف تلألؤ كيميائي محسن (ECL) وانشر المحلول المختلط برفق على الغشاء لتطوير الإشارات.

6. الحصول على الصور باستخدام نظام التصوير والقياس الكمي للبيانات

1. انقل لوحة التصوير إلى المقصورة المناسبة على نظام التصوير للتصوير. افتح برنامج التصوير على الكمبيوتر لمعالجة الصور.
2. على شريط الأدوات، انقر فوق بروتوكول جديد واختر قناة واحدة. انقر فوق تحديد ضمن مربع الحوار تصوير الهلام/التطبيق، وقم بالتمرير إلى Blot وحدد إما Chemi Hi Sensitivity أو Chemi Hi Resolution. ثم انقر فوق إعداد تراكم الإشارة لتعيين مدة وعدد الصور المراد الحصول عليها.
3. انقر فوق Position Gel ضمن إعداد البروتوكول واضبط الجل في نظام التصوير إذا لزم الأمر. انقر فوق تشغيل البروتوكول للحصول على الصور.
4. انقر بزر الماوس الأيمن على إحدى الصور المكتسبة أسفل مربع كتالوج التصوير لحفظ الصور على الكمبيوتر. انتقل إلى الصورة المطلوبة وانقر فوق تحديد صورة ومتابعة أسفل مربع الحوار تشغيل.
5. انقر فوق أيقونة Image Transform لضبط التباين وتشبع البكسل للصورة. انقر فوق أيقونة لقطة الشاشة في شريط الأدوات العام لحفظ الصورة على الكمبيوتر اعتمادا على تنسيق الصورة المطلوب.
6. قياس كثافة النطاق باستخدام برنامج ImageJ وتحليله باستخدام الأدوات الإحصائية المناسبة.

النتائج

الجدول 1: وصفة لصنع مزيج هلام بولي أكريلاميد (فصل وتكديس محاليل الهلام).

<فئة الشكل = نمط الجدول = 'العرض: 96.82٪؛ '><فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = ';'>< td style = 'background-color: white ؛ border: 1.0pt black solid ؛ padding: 3.75pt 2.25pt ؛ width: 175.9pt ؛ ' colspan = '2'> 8 مل من 8٪ جل فصل

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
40٪ acrylamide	Sigma-Aldrich	A2917	used to make separation and stacking gel for SDS-PAGE
الأمونيوم لكل كبريتات
anti pSPAK	Dundee University
جامعة دندي	S700C	يستخدم كجسم مضاد أساسي للنشاف
anti-KCC2 pSer940	Thermo Fisher Scientific	PA5-95678	يستخدم كجسم مضاد أساسي للنشاف الغربي
anti-KCC2 pThr1007	جامعة دندي	S961C	يستخدم كجسم مضاد أساسي للنشاف
anti-KCC2 pThr906	Dundee University	S959C	يستخدم كجسم مضاد أساسي للنشاف
anti-mouse	تقنية إشارات الخلية	66002	تستخدم كجسم مضاد ثانوي للنشاف
anti-NKCC1	Dundee University	S841B	يستخدم كجسم مضاد أساسي للنشاف
anti-NKCC1 pThr203/207/212	Dundee University	S763B	يستخدم كجسم مضاد أساسي للنشاف
anti-rabbit	Cell Signalling	C29F4	يستخدم كجسم مضاد ثانوي للنشاف
مضاد للأغنام	abcam	ab6900	يستخدم كجسم مضاد ثانوي للنشاف
anti-SPAK	Dundee University	S669D	يستخدم كجسم مضاد أساسي للنشاف
anti-β-Tubulin III	Sigma-Aldrich	T8578	يستخدم كجسم مضاد أساسي للنشاف
Benzamine	Merck UK	135828	used كمكون من مكونات المخزن المؤقت
Beta-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich<	used كمكون من مكونات التحميل المخزن المؤقت والتحلل
Bradford Coomasie	Thermo Scientific	1856209	used for reduce
Casting	Atto	WSE-1165W	يستخدم لتشغيل الرحلان
Centrifuge	Eppendorf	5804	used in lysate
Centrifuge	VWR	MicroStar 17R	used for Rolling Samples
D6429	used for cell
ECL reagent	Perkin Elmer	ORTT755/2655	used to develop image for western blotting
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	used كمكون من مكونات المخزن المؤقت
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	used كمكون من مكونات المخزن المؤقت
Electrophoresis Power Supply	BioRad	PowerPAC HC	To supply power لتشغيل الرحلان الكهربائي لصفحة SDS
Ethanol	ThermoFisher	E / 0650DF/17	يستخدم لإعداد المعدات المعقمة والبيئة	مصل الأبقار الجنينية - معطل الحرارة
Merck Life Sciences UK	F9665	used for cell culture
Fumehood	Walker	A7277	used for cell culture
Gel Blotting - Whatman	GE Healthcare	10426981	used in vernting to make transfer sandwich
Glycine	Sigma-Aldrich	15527	used to make the buffers
GraphPad Prism Software	GraphPad Software, Inc., USA	Version 6.0	used لرسم الرسوم البيانية وتحليل البيانات للنشاف
HCl	Acros Organics	10647282	يستخدم لصنع جل الفصل والتكديس ل SDS-PAGE
Heating block	Grant	QBT1	used to تسخين عينات
HEK293 cells	Merck UK	12022001-1VL	Cell line for culture experiment
ImageJ Software	Wayne Rasband and Contributors; المعاهد الوطنية للصحة ، الولايات المتحدة الأمريكية	تستخدم لقياس شدة النطاق من صور
نظام التصوير	BioRad	ChemiDoc MP	used to taking western blotting images
Incubator	LEEC	LEEC precision 190D	يستخدم لزراعة
كبريتات الليثيوم دوديسيل (LDS)	Novex	NP0008	يستخدم كمخزن مؤقت للتحميل للنشاف الغربي	MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية	Merck Life Sciences UK	M7145	used for cell
Microcentrifuge	Eppendorf	5418	used for preparation lysates for WB
Microplate reader	BioRad	iMark	used for lysate concentration protein readout
Microsoft Powerpoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	تستخدم لتحرير صور
علامة الوزن الجزيئي	BioRad	1610373	used for western blotting
N-ethylmaleimide	Thermo Fisher Scientific
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	used for the cell
pH Meter	Mettler Toledo	Seven compact s210	used لمراقبة درجة الحموضة في المحاليل
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	used كمكون من مكونات المخزن المؤقت
Phosphate Buffer Saline	Sigma-Aldrich	D8537	used for cell culture
PKCδ pThr505	Cell Signalling	9374	يستخدم كجسم مضاد أساسي للنشاف
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	used for immunoprecipitation
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	يستخدم كمكون من مكونات المخزن المؤقت للغسيل
Sigma-Aldrich	S6508	used كمكون من مكونات المخزن المؤقت
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	used for the cell
sodium-β-glycerophosphate	Merck UK	G9422	used كمكون من مكونات المخزن المؤقت
Staurosporine (من Streptomyces sp.)	Scientific Laboratory Supplies, UK	S4400-1MG	used for cell culture
Sucrose	Scientifc Laboratory Supplies	S0389	used كمكون من مكونات المخزن المؤقت
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	يستخدم لصنع جل الفصل والتكديس ل SDS-PAGE
Transfer Chamber	BioRad	1658005EDU	يستخدم في النشاف الغربي لنقل البروتين على الغشاء
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	يستخدم لصنع جل الفصل والتكديس ل SDS-PAGE
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	used كمكون من مكونات المخزن المؤقت
Trypsin-EDTA Solution	T4049	used for cell culture
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	used as make TBS-T buffer
Vacuum	Charles Austen	Dymax 5	used for cell culture
Vortex	Scientific Industries	K-550-GE	used in sample preparation
Vortex mixer	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie K-550-GE	تستخدم لخلط العينة
حمام الماء	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	تستخدم لاحتضان الحلول