القياس الكمي لخلايا العقدة الشبكية بعد ارتفاع ضغط الدم العيني الناجم عن الكي

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Lani-Louzada، R.، وآخرون . الكي الكامل للضفيرة الوعائية القزحية للجلوكوما المستحثة جراحيا في القوارض. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح هذا الفيديو القياس الكمي للخلايا العقدية الشبكية من شبكية الفئران الثابتة كيميائيا المعرضة للكي الكامل للضفيرة الوعائية القصوية. تشمل العملية النفاذية ، وتلوين الأجسام المضادة ، والتلوين النووي المضاد ، متبوعا بالتصور تحت مجهر التألق لتقييم تأثير الضغط المرتفع داخل العين على بقاء الخلايا العقدية الشبكية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. القياس الكمي لخلايا العقدة الشبكية

ملاحظة: الإجراء التالي هو القياس الكمي ل RGC somas ، بناء على التلوين الكيميائي المناعي للحوامل المسطحة في الشبكية بجسم مضاد ضد بروتين المجال المثلي / POU الخاص بالدماغ 3A (Brn3a).

انقل شبكية العين المعزولة إلى صفيحة مزرعة مكونة من 24 بئرا (شبكية واحدة لكل بئر) تحتوي على 1 مل من 1x PBS وحافظ على الشبكية الداخلية متجهة لأعلى.
تخلل الأنسجة عن طريق غسل 3 مرات لمدة 10 دقائق باستخدام خافض للتوتر السطحي غير أيوني 0.5٪ مخفف في 1x PBS (0.3 مل). ثم حافظ على اهتزاز الأنسجة برفق في 5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في خافض للتوتر السطحي غير أيوني 2٪ و 1x PBS (محلول مانع ؛ 0.25 مل) لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
خلال الخطوة 1.2 ، قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الأولية Brn3a عن طريق تخفيف 1: 200 في الفاعل بالسطح غير الأيوني 0.5٪ و 1x PBS بالإضافة إلى 5٪ BSA ، وتخزينه في 4 درجات مئوية.
بعد 60 دقيقة من انسداد الأنسجة ، احتضان شبكية العين في 0.2 مل من محلول الأجسام المضادة الأولية عند 4 درجات مئوية لمدة 72 ساعة مع رج لطيف.
اغسل الأنسجة 3x لمدة 10 دقائق باستخدام 1x PBS ، ثم احتضن الأنسجة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في 0.2 مل من محلول الجسم المضاد الثانوي المخفف 1: 750 في 1x PBS بالإضافة إلى 5٪ BSA.
علاوة على ذلك ، احتضان الأنسجة لمدة 10 دقائق في محلول مضاد للبقع النووية لتلوين نوى الفلورسنت. اختتم الكيمياء المناعية بخطوة غسيل أخيرة باستخدام 1x PBS (0.3 مل) متكرر 3x.
انقل شبكية العين بمساعدة فرشتين صغيرتين على شرائح المجهر الزجاجي ، مع الحفاظ على الجانب الزجاجي لأعلى. ضع ربع الشبكية الظهرية لأعلى على شرائح المجهر. قم بعمل قطعتين شعاعيتين أخريين باتجاه رأس العصب البصري لتحديد الأرباع الثلاثة الأخرى (الأنف والبطني والزماني).
ملاحظة: أبعاد القطع غير ثابتة. يجب ألا تكون قصيرة جدا مما يضعف التسطيح الفعال لشبكية العين على الشريحة ويجب ألا تكون طويلة جدا بحيث تصل إلى ثقب العصب البصري وتفصل تماما ربع الشبكية المحدد عن بقية الأنسجة.
أخيرا ، ضع 0.2 مل من وسط التثبيت المضاد للبهتان على غطاء زجاجي وضعه على شبكية العين المثبتة بشكل مسطح لتحليل الأنسجة المجهرية. لتقدير كثافة RGCs ، افحص الحوامل المسطحة تحت مجهر التألق الليبي بؤر باستخدام هدف 40x / 1.3.
لكل ربع من شبكية العين ، التقط ثماني صور: اثنتان من الشبكية المركزية (~ 0.9 مم من القرص البصري) ، وثلاث من منتصف الشبكية (~ 2.0 مم من القرص البصري) ، وثلاث من شبكية العين المحيطية (~ 3.7 مم من القرص البصري) ، بإجمالي 32 صورة لكل شبكية العين. استخدم برنامج FIJI لحساب الخلايا الإيجابية ل Brn3a وتقدير متوسط كثافة الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

< فئة الشكل = نمط الجدول = 'العرض: 844 نقطة ؛ '><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> < نمط عمود = 'العرض: 20.26٪ ؛ '>< نمط عمود = 'العرض: 28.08٪ ؛ '>< نمط العمود = 'العرض: 13.39٪ ؛ '>< نمط عمود = 'العرض: 38.27٪ ؛ '>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < نمط td = 'نمط الحدود: لا شيء ؛ الارتفاع: 15.5pt ؛ العرض: 171 نقطة ؛ '>DAKO< td style = 'border-left-style: none ؛ border-<>left-style: none ؛ 'bound-left-style: none ؛ '>S3023 < td style = 'نمط الحدود الأيسر: لا شيء ؛ نمط الحدود العلوي: لا شيء ؛ العرض : 323pt ؛ '> وسيط التركيب المضاد للتلاشي < نمط td = 'نمط الحدود: لا شيء ؛ الارتفاع: 15.5 نقطة ؛ العرض: 171pt ؛ '>LSM 510 Meta < td style = 'نمط اليسار الحدود: لا شيء ؛ نمط الحدود العلوي: لا شيء ؛ العرض : 237pt ؛ '>Carl Zeiss < td style = 'نمط اليسار الحدود: لا شيء ؛ نمط الحدود العلوي: لا شيء ؛ العرض: 113pt ؛ '> -< td style = 'نمط اليسار الحدود: لا شيء ؛ نمط الحدود العلوي: لا شيء ؛ العرض: 323pt ؛ '> التألق النحان متحد البؤر المجهرmonoclonal IgG1 anti-Brn3aMilliporeSigmaMAB-1585Brn3a محلول الجسم المضاد الأوليto-PRO-3Thermo Fisher ScientificT3605Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nmTriton X-100Sigma-Aldrich9036-19-5non-ionic surqantIgG donkey المضاد للجسم المضاد للفأر + Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA31570Secondary Antibody SolutionDAPIThermo Fisher Scientific28718-90-3diamidino-2-phenylindole; silverescent nuclear counterstain; الانبعاث عند 452±3 نانومتر

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن