تحليل ديناميكيات الكالسيوم والتغيرات المحتملة للغشاء في البطانة البطانية الشريانية للفأر

الملخص

المصدر: حكيم ، م. أ. وآخرون . ، العزل والتحليل الوظيفي للبطانة البطانية الشريانية لحمة دماغ الفأر. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح هذا الفيديو التحليل الوظيفي للأنبوب البطاني الشرياني المعزول من دماغ الفأر. يحدد خطوات قياس مستويات الكالسيوم داخل الخلايا وإمكانات الغشاء ، سواء في خط الأساس أو استجابة للتحفيز الدوائي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل أخلاقيات المناسبة لجنة المراجعة.

1. المواد والمعدات

NOTE: see the جدول المواد لجميع الكواشف والمواد المطلوبة لهذا البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا الرجوع إلى الكتيبات والمواقع الإلكترونية المرتبطة بالبائعين المعنيين حسب الحاجة.

1. Flow chamber
   1. اربط غرفة hyperfusion بغطاء زجاجي على منصة مكونة من الألومنيوم المؤكسد. قم بتأمين المنصة بالغرفة على مرحلة مجهر الألومنيوم.
   2. NOTE:
   3. قم بإعداد الجهاز التجريبي عن طريق ترتيب مجهر مقلوب (الأهداف: 4x و 10x و 20x و 40x و 60x) ومرحلة يدوية من الألومنيوم على طاولة عزل الاهتزاز.
   style='لون الخلفية:شفاف;اللون:#00000;عائلة الخط:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='1'> _م < نمط الامتداد = 'عائلة الخط: Arial ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس ؛ المساحة البيضاء: التفاف مسبق ؛ معدات التسجيل >
   1. قم بتوصيل المقياس الكهربائي بواجهة متوافقة. استخدم الملحقات ، مثل مولد الوظائف والمحفز ، للبروتوكولات التي تتطلب حقن التيار.
   2. ²⁺]_i في الخلايا البطانية.
   3. NOTE: سيحتاج المجرب إلى مجتذب زجاج إلكتروني وmicroforge لإعداد التثبيت الماصات.
      1. لتأمين الأنبوب البطاني في غرفة الانصهار الفائق، قم بإعداد ماصات تثبيت مصقولة بالحرارة بنهاية كروية ضعيفة (القطر الخارجي: 50-70 ميكرومتر) محضرة من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات ذات الجدران الرقيقة. style='لون الخلفية:شفاف;اللون;color:#00000;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='2'> _م < نمط الامتداد = 'font-family: Arial ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس. المساحة البيضاء: التفاف مسبق ؛ > الخلية البطانية ، قم بإعداد أقطاب كهربائية حادة بمقاومة طرف ~ 150 ± 30 MΩ من الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام مجتذب الزجاج فقط.

   2. solutions and drugs

   1. قم بإعداد ما لا يقل عن 1 لتر من PSS باستخدام 140 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي مولار KCl ، 2 ملي CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES) و 10 mM glucose.
   2. ₂ (صفر Ca²⁺ PSS) لتشريح الشرايين الدماغية وعزل البطانة انابيب.
      NOTE: جهز الكل الحلول في نمط H النقاء = 'font-family: Arial ، sans-serif ؛ حجم الخط: 0.6em ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس ؛ المساحة البيضاء: التفاف مسبق ؛ '>₂
   3. Prepare Fura-2 AM مخزون في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO؛ 1 ملليمتر). تحضير 500 ميكرولتر من تركيز العمل (10 ميكرومتر) عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من المخزون إلى 495 ميكرولتر من PSS للتحميل.
   5. Prepare 2M KCl عن طريق إذابة KCl في نمط H ='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;line-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;-space:pre-wrap;'₂O (7.455 جم من KCl في 50 مل من نمط H₂O). مرر المحلول من خلال حقنة بفلتر 0.22 ميكرومتر قبل ردم الأقطاب الكهربائية الحادة.

3. استخدام الأنابيب البطانية الشريانية لفحص علم وظائف الأعضاء الخلوي

NOTE:²⁺]_i dynamics and V_m باستخدام القياس الضوئي والفيزيولوجيا الكهربية الحادة للقطب الكهربائي، على التوالي، كما هو موضح سابقا (الشكل 1). [كاليفورنيا²⁺]_i and V_m يمكن قياسها كمتغيرات تجريبية منفصلة أو مجمعة (الشكل 1

قياس [Ca²⁺]_i

^{2 +} < نمط الامتداد = 'عائلة الخط: Arial ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس ؛ المساحة البيضاء: التفاف مسبق ؛ >]_i recordings with keeping hyperfusion المستمر بمعدل تدفق 5-7 مل/ دقيقه.
1. ^{2 +} < نمط الامتداد = 'font-family: Arial ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس. المساحة البيضاء: التفاف مسبق ؛ > صبغة Fura-2 AM لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخلايا بمحلول الانصهار الفائق لمدة 20-30 دقيقة أخرى مع رفع درجة حرارة الحمام تدريجيا إلى 37 درجة مئوية. حافظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية طوال التجربة.
2. الشكل 1A²⁺]_i by exciting Fura-2 بالتناوب (≥10 هرتز) عند 340 نانومتر و 380 نانومتر أثناء جمع انبعاث التألق عند 510 نانومتر. مرة واحدة تسجيل خط أساس مستقر ل [Ca^{2 +} _i established and apply drug (e.g., purinergic receptor ناهضات) وفقا للهدف التجريبي (الشكل 1 ب < نمط الامتداد = 'عائلة الخط: Arial ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس ؛ المسافة البيضاء: التفاف مسبق ؛ >).

style='لون الخلفية:شفاف;اللون:#00000;عائلة الخط:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='1'> _م < الامتداد = 'عائلة الخط: Arial ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس ؛ المساحة البيضاء: التفاف مسبق ؛ نمط >

1. _م < نمط الامتداد = 'عائلة الخط: Arial ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس. المساحة البيضاء: التفاف مسبق ؛ > التسجيلات وضبط معدل الحصول على البيانات (≥10 هرتز) مع الحفاظ على التدفق الفائق المستمر بمعدل تدفق 5-7 مل / دقيقة. ارفع درجة حرارة الحمام تدريجيا إلى 37 درجة مئوية واحتفظ بها حتى نهاية التجربة.
2. _م < نمط الامتداد = 'عائلة الخط: Arial ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس. المساحة البيضاء: التفاف مسبق ؛ > باستخدام مقياس كهربائي (الشكل 1A).

once the the intholial resting V_m stable (-30 to -40 mV), تطبيق الدوائية المطلوبة وكلاء لكل هدف تجريبي (الشكل 1C).

النتائج

الشكل 1: تطبيق الأنبوب البطاني للفحص الفسيولوجي للمسارات المتعلقة بتنظيم تدفق الدم. ( A ) يتم وضع قطب كهربائي حاد (سهم أرجواني) في خلية من أنبوب بطاني يركز في نافذة الحصول على البيانات للقياس الضوئي. (B) التسجيل التمثيلي ل Ca ^{2 +} باستخدام القياس الضوئي Fura-2 استجابة ل MTA (1 ميكرومتر). (C) التسجيل التمثيلي ل V_m متزامن مع تتبع C...

المواد

<فئة الشكل = نمط "الجدول" = "العرض: 1104pt ؛" ><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات amplifiersMolecular Devices, Sunnyvale, CA, USAAxoclamp 2B & Axoclamp 900A شاشات خط الأساس المسموعةAmpol US LLC، ساراسوتا، فلوريدا، الولايات المتحدة الأمريكية BM-A-TM <نمط TD = 'الارتفاع: 14.5 نقطة ؛ '> مبرد الحمام (Isotemp 500LCU) ThermoFisherScientific 13874647 < td style = 'الارتفاع: 14.5 نقطة ؛' >الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات (التثبيت) Warner InstrumentsG150T-6 الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات (أقطاب كهربائية حادة) Warner InstrumentsGC100F-10 BSA: ألبومين مصل الأبقارSigmaA7906 CaCl2: كلوريد الكالسيومسيجما223506 نمط DMSO: ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجماD8418 صمام التحكم في التدفقWarner Instruments FR-50 واجهة نظام التألق ، مصباح ARC وإمدادات الطاقة ، hyperswitch و PMTMolecular Devices ، Sunnyvale ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكيةأنظمة IonOptix مولد الوظيفةEZ Digital ، سيول ، كوريا الجنوبيةFG-8002 < td style = 'height: 14.5pt ؛ '>Fura-2 AM صبغInvitrogen ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكيةF14185 Glucoseسيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) G7021 HCl: حمض الهيدروكلوريكThermoFisher Scientific (بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)A466250 HeadstagesMolecular DevicesHS-2A & HS-9A HEPES: (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid) SigmaH4034 سخان الحلالمضمن Warner InstrumentsSH-27B KCl: كلوريد البوتاسيومSigmaP9541 MgCl2: كلوريد المغنيسيومSigmaM2670 MicroforgeNarishige, East Meadow, NY, USA, MF-900 MicromanipulatorSiskiyou MX10 مجتذب ماصة دقيقة (رقمي)Sutter Instruments، Novato، CA، الولايات المتحدة الأمريكيةP-97 أو P-1000 المجهر (Nikon-inverted)Nikon Instruments Inc، Melville، NY، الولايات المتحدة الأمريكيةTs2 المجهر ( Nikon-inverted)Nikon Instruments IncEclipse TS100 Microscope GoalsNikon Instruments Inc20X (S-Fluor) و 40X (Plan Fluor) منصة المجهر (الألومنيوم المؤكسد؛ القطر، 7.8 سم)Warner InstrumentsPM6 أو PH6 مرحلة المجهر (الألومنيوم)Siskiyou ، Grants Pass ، OR ، الولايات المتحدة الأمريكية8090P MTA: 2-Methylthioadenosine ثنائي فوسفات ملح ثلاثي الصوديومTocris1624 NaCl: كلوريد الصوديومSigmaS7653 NaOH: هيدروكسيد الصوديومSigmaS8045 راسم الذبذباتTektronix ، بيفرتون ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية TDS 2024B أهداف تباين المرحلةNikon Instruments Inc (Ph1 DL ؛ 10X & 20X) < td style = 'height: 14.5pt ؛ '> Plexiglas superfusion chamberWarner Instruments ، Camden ، CT ، الولايات المتحدة الأمريكيةRC-27 المجاهر المجسمZeiss ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكيةStemi 2000 & 2000-C مرشح حقنة (0.22 ميكرومتر) ThermoFisher Scientific722-2520 وحدة التحكم في درجة الحرارة (قناة مزدوجة) Warner InstrumentsTC-344B أو C نظام التحكمفي الصمام Warner InstrumentsVC-6 التصنيع الفني لطاولة عزل الاهتزاز، بيبودي ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية Micro-g