تقييم مستويات الناقل العصبي الضثاري في الفئران الناجمة عن الصرع المزمن

الملخص

المصدر: Soukupová, M., et al. غسيل الكلى المجهري للأحماض الأمينية المثيرة أثناء تسجيلات مخطط كهربية الدماغ في الفئران التي تتحرك بحرية. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو تقييم مستويات الناقل العصبي الضثاري خارج الخلية في الفئران المصابة بتحريض الصرع المزمن. بعد زرع مسبار غسيل الكلى المجهري في الدماغ وتأكيد عدم وجود نوبات باستخدام تخطيط كهربية الدماغ (EEG) ، يتم جمع السائل خارج الخلية لتقييم مستويات الناقل العصبي المرتفعة في الفئران المصابة بالصرع. ثم يتم غرس محلول عالي البوتاسيوم للحفاظ على استثارة الخلايا العصبية وتحفيز زيادة إطلاق الناقلات العصبية ، مع جمع العينات لتقييم الذروة التي يسببها البوتاسيوم في الناقلات العصبية المثيرة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

تم تعديل هذا البروتوكول خصيصا لتحديد الغلوتامات والأسبارتات في حالات غسيل الكلى في دماغ الفئران التي تم الحصول عليها تحت سيطرة مخطط كهربية الدماغ لجلسات غسيل الكلى المجهري في الفئران المصابة بالصرع وغير الصرع. يمكن استبدال العديد من المواد الموضحة هنا بسهولة بتلك التي يستخدمها المرء في مختبره لتسجيلات مخطط كهربية الدماغ أو غسيل الكلى المجهري.

1. تجميع جهاز مسبار الغسيل الكلوي المجهري

1. استخدم قطبا كهربائيا ملتويا من 3 قنوات (بطول قطع 20 مم على الأقل من القطب الكهربائي المسجل وقطب تأريض بطول 10 سم) وقم بإقرانه بقنية توجيه لإعداد الجهاز. انظر أمثلة على قطب كهربائي ثلاثي القنوات وقنية توجيه لغسيل الكلى في الشكل 1A-1B.
2. قم بإزالة ( الشكل 1C ) وأدخل ( الشكل 1D ) قنية التوجيه المعدنية في القنية البلاستيكية الوهمية عدة مرات قبل الاستخدام لتسهيل إزالتها في لحظة تبديلها لمسبار غسيل الكلى المجهري في.
3. ثني الأسلاك الملتوية لتسجيل القطب مرتين ( الشكل 1E-1F ) لمحاذاة الأسلاك مع القنية الوهمية للدليل وقطع طرف القطب الكهربائي ( الشكل 1G ) ليكون أطول بمقدار 0.5 مم من طرف قنية التوجيه ( الشكل 1H ) باستخدام الفرجار الرقمي.
4. جهز دائرة السيليكون بطول 1 مم (OD 2 مم ، سمك 0.3 مم ؛ الشكل 1I ) وأدخل طرف قنية التوجيه وطرف الأقطاب الكهربائية الملتوية في دائرة السيليكون باستخدام الملقط ( الشكل 1J ). قم بتثبيته على سفح قاعدة قنية التوجيه بغراء بوليمر سريع المفعول أو الراتنج ( الشكل 1K ). انظر مثال الأجهزة المكتملة في الشكل 1L والشكل 2 أ .
5. تعقيم الجهاز تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية المبيد للجراثيم لمدة 4 ساعات. اقلب الجهاز أربع مرات بحيث يتعرض كل جانب من جوانبه للضوء لمدة ساعة.
   }ملاحظة: يمكن تجميع العديد من الأقطاب الكهربائية محلية الصنع ومجسات غسيل الكلى المجهري بطريقة مماثلة. رأس الغرسة الموصوفة أعلاه للفئران له الأبعاد التالية: عرض 7 مم × عمق 5 مم × طول 10 مم من أعلى إلى إصبع القدم ؛ يبلغ طول طرف الغرسة حوالي 11 مم وقطره 600 ميكرومتر ويبلغ وزن جميع الأجهزة حوالي 330-360 مجم. يمكن إعادة استخدام الجهاز مرتين أو ثلاث مرات إذا (1) ترك طول كاف من القطب الأرضي على الجمجمة أثناء الجراحة للاستخدام التالي و (2) عندما يقتل ، ويستعيد الجهاز مع أسمنت الأسنان ، يترك في الأسيتون طوال الليل ، بحيث يمكن فصل الأسمنت ميكانيكيا ، وغسل الجهاز وتعقيمه مرة أخرى.

2. الجراحة التجسيمية

1. استخدم جهازا تجسيما وحامل مشبك مسبار ( الشكل 2 ب ) لزرع الجهاز وفقا للمعايير المعاصرة للجراحات المعقمة والخالية من الألم.
   1. قم بتخدير فئران Sprague-Dawley البالغة بخليط الكيتامين / الزيلازين (43 مجم / كجم و 7 مجم / كجم ، IP) وتثبيته على الإطار التجسيمي. أضف تخدير الأيزوفلوران (1.4٪ في الهواء ؛ 1.2 مل / دقيقة) إلى حقن الكيتامين / الزيلازين الأولي لأنه يسمح بالتحكم في عمق التخدير في الوقت المناسب. احلق الفراء على رأس.
2. امسح سطح جلد الرأس بمحلول قائم على اليود متبوعا ب 70٪ إيثانول لتحضيره للجراحة المعقمة.
   1. زرع جهاز قنية التوجيه المحضرة بالأسبقية (1.1 - 1.5) في الحصين البطني الأيمن باستخدام الإحداثيات التالية: قضيب الأنف + 5.0 مم ، A - 3.4 مم ، L + 4.5 مم ، P + 6.5 مم إلى bregma. اتبع التقنيات القياسية للجراحات التجسيمية.
   2. تأكد من أنه لا يغطي مسامير التثبيت. عند تركيبه على الجهاز التجسيمي ، أمسك الجهاز الخاص برأس قنية التوجيه حيث يمكن محاذاة ذلك بسهولة مع حامل المسبار.
3. قم بتثبيت الجهاز على الجمجمة باستخدام أربعة مسامير غير قابلة للصدأ على الأقل لتثبيتها في عظم الجمجمة (1 برغي في اليسار و 1 برغي في صفائح العظام الأمامية اليمنى ، وبرغي واحد في الجدارية اليسرى و 1 برغي في ألواح العظام بين الجدارية). أضف قطرة من غراء المناديل لتثبيت كل برغي في عظم الجمجمة.
   1. قم بتغطية نصف الخيوط اللولبية بأسمنت الميثاكريليك. تعزيز ارتباط الأسمنت عن طريق عمل أخاديد ضحلة في العظم لزيادة الالتصاق.
4. بمجرد وضع طرف الجهاز في أنسجة المخ ، قم بلف سلك القطب الأرضي حول 3 مسامير تثبيت. قم بتغطية جميع البراغي المثبتة والجهاز بأسمنت الأسنان.
5. راقب أثناء الجراحة ولمدة ساعة بعد ذلك حتى تكون منتصبة وتتحرك حول القفص. احتفظ بها على وسادة تسخين لتجنب انخفاض حرارة الجسم. اسمح للفئران بالتعافي لمدة 7 أيام على الأقل بعد زرع الجهاز.
6. راقب مرة واحدة على الأقل يوميا لمدة 3 أيام بعد الجراحة بحثا عن علامات الألم أو الضيق. إعطاء مع كريم المضادات الحيوية (جنتاميسين 0.1٪) بالقرب من الموقع المقطوع للوقاية من العدوى ومسكن (ترامادول 5 ملغ/كغ، داخل الصفاق [i.p.]) لمدة 3 أيام لمنع ألم ما بعد الجراحة.

3. تحريض صرع الفص الصدغي عن طريق بيلوكاربين وتعيين للمجموعات التجريبية

1. بعد أسبوع من التعافي بعد الجراحة ، قم بتعيين بشكل عشوائي للمجموعات: (أنا) المراقبة التي تتلقى مركبة و (ب) المصابة بالصرع التي ستتلقى بيلوكاربين. استخدم عددا أكبر نسبيا من لمجموعة الصرع حيث لن تصاب جميع الفئران التي تتناولها البيلوكاربين بالمرض.
2. حقن جرعة من ميثيل سكوبولامين (1 ملغم/كغ، تحت الجلد [s.c.]) وبعد 30 دقيقة، حقنة واحدة من بيلوكاربين (350 ملغ/كغ، المثبط العنوي) للحث على حالة الصرع (SE). حقن ميثيل سكوبولامين والمركبة (محلول ملحي) في الفئران الضابطة. استخدم حقنة 1 مل مع إبرة 25G لجميع إدارات IP.
   1. تحقق بصريا من لتبدأ في الإصابة بنوبات سلوكية (تحريك الاهتزاز في غضون 5 دقائق ، إيماءة الرأس ، استنساخ الأطراف) وفي غضون 25 دقيقة لاستنساخ كل الجسم بشكل مستمر (SE).
3. القبض على SE 2 ساعة بعد البداية ليكون معدل الوفيات حوالي 25٪ ومتوسط فترة كامنة من حوالي 10 أيام عن طريق إعطاء الديازيبام (20 ملغ/كغ, i.p.). راقب وسجل أي سلوك نوبة يبدأ مباشرة بعد حقن البيلوكاربين واستمر لمدة 6 ساعات على الأقل بعد ذلك.
4. أعط محلول ملحي (1 مل ، i.p.) باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 25G ومحلول سكروز (1 مل ، لكل نظام التشغيل [p.o.]) باستخدام حقنة 1 مل وإبرة تغذية مرنة 17G لمدة 2-3 أيام بعد SE لتعزيز استعادة فقدان وزن الجسم.
   1. استبعاد التي لا تحقق وزن الجسم الأولي خلال الأسبوع الأول بعد بيلوكاربين SE من الدراسة (باستثناء المجموعة الحادة التي قتلت بعد 24 ساعة من SE ، حيث لا يمكن متابعة وزن الجسم).
5. قم بتعيين ما بعد SE بشكل عشوائي لمجموعات تجريبية مختلفة ( الشكل 3 ): المرحلة الحادة (حيث يتم غسيل الكلى المجهري بعد 24 ساعة من SE) ، والكمون (7-9 أيام بعد SE) ، والنوبة العفوية الأولى (حوالي 11 يوما بعد SE) ، والفترة المزمنة (تبدأ حوالي 22-24 يوما بعد SE ، أي بعد حوالي 10 أيام من النوبة الأولى). مراقبة لحدوث النوبات التلقائية.
   ملاحظة: استخدم معايير الإدراج / الاستبعاد التالية لمزيد من التجارب على الفئران المصابة بالصرع: تطور SE المتشنج في غضون ساعة واحدة بعد إعطاء بيلوكاربين. زيادة الوزن في الأسبوع الأول بعد SE والوضع الصحيح لمسبار غسيل الكلى المجهري والقطب.

4. مراقبة وتحليل سلوك الصرع

1. المراقبة طويلة المدى لسلوك الصرع
   1. بعد حوالي 6 ساعات من إعطاء بيلوكاربين ( أي ، في نهاية الملاحظة المباشرة من قبل الباحثين) ، ضع في أقفاص المنزل النظيفة وابدأ المراقبة بالفيديو لمدة 24 ساعة.
   2. استمر في مراقبة الفيديو لمدة 24 ساعة حتى اليوم 5, باستخدام نظام المراقبة بالفيديو الرقمي.
   3. بدءا من اليوم الخامس ، قم بتوصيل الفئران في أقفاص مستطيلة منزلها بنظام تسجيل مخطط كهربية الدماغ المربوط واستمر في مراقبة الفيديو على مدار 24 ساعة.
   4. اضبط المعلمات على مكبر الصوت الموجود خارج قفص فاراداي (اضبط عامل التضخيم على كل قناة وفقا لخصوصية إشارة مخطط كهربية الدماغ لكل على حدة) وابدأ اكتساب مخطط كهربية الدماغ مع مراعاة إشارة مخطط كهربية الدماغ التي تنتجها الكابلات غير المتصلة. استخدم معدل أخذ العينات 200 هرتز ومرشح التمرير المنخفض مضبوطا على 0.5 هرتز.
   5. قم بتوصيل بالكابلات التي تمسك برأس بين إصبعين ممدودين من يد واحدة وقم بربط الموصلات بقاعدة القطب باستخدام اليد الحرة الأخرى. ابدأ عملية الاستحواذ.
      تنبيه: تأكد من خلو الإشارة من القطع الأثرية. القطع الأثرية الشائعة هي المسامير التي تتجاوز المقياس بشكل كبير.
   6. قبل يوم واحد من تجربة غسيل الكلى المجهري ، انقل إلى نظام مخطط كهربية الدماغ المربوط المجهز بأسطوانات زجاجية شبكية لغسيل الكلى المجهري. افصل عن نظام ربط مخطط كهربية الدماغ في قفص المنزل ، مما يؤدي إلى شد الموصلات من القطب دون كبح جماح. ضع في أسطوانات زجاج شبكي عالية.
2. مراقبة سلوك الصرع قبل وأثناء جلسة غسيل الكلى المجهري
   1. قم بتشغيل مكبر الصوت الموجود خارج قفص فاراداي. افتح برنامج مخطط كهربية الدماغ. ابدأ الحصول على مخطط كهربية الدماغ من خلال مراقبة إشارة EEG التي تنتجها الكابلات غير المتصلة.
   2. قم بتوصيل بنظام تسجيل مخطط كهربية الدماغ المربوط ، مع إمساك رأس بين إصبعين ممدودين من يد واحدة وربط الموصلات بقاعدة القطب الكهربائي باستخدام اليد الحرة الأخرى. قم بتعيين عامل تضخيم (كسب) على كل قناة من مكبر الصوت وفقا لإشارة القطب الكهربائي لحيوان واحد بحيث تكون إشارة مخطط كهربية الدماغ في الحجم. دع يستكشف القفص الجديد (الأسطوانة) لمدة 1 ساعة على الأقل تحت الملاحظة المباشرة للباحث.
   3. ملاحظة: قبل 24 ساعة من تجربة غسيل الكلى المجهري ، يتم تخدير الفئران لفترة وجيزة بالأيزوفلوران لتبديل قنيات التوجيه إلى مسبار غسيل الكلى المجهري. استفد من اللحظة التي يتم فيها تخديرها لتوصيلها بنظام تسجيل مخطط كهربية الدماغ.
   4. تقصير أو إطالة الكابل المتدلي حسب سلعة. تأكد من أن الكابلات لا تتداخل مع حركات ووضعية الاستلقاء.
   5. تحقق من وجود تأطير الصورة الصحيح لكاميرات الفيديو. ابدأ تسجيل مخطط كهربية الدماغ بالفيديو.
3. تحديد النوبات ونشاط مخطط كهربية الدماغ
   1. استخدم مشغل برامج لمشاهدة مقاطع الفيديو. قم بالتمرير في الفيلم 8 مرات أسرع من اللعب في الوقت الحقيقي وقم بتفرد النوبات المعممة (انظر للخلف باستخدام نسيل الطرف الأمامي أو تربية والسقوط باستخدام نسيل الطرف الأمامي). قم بإبطاء الفيديو ولاحظ الوقت الدقيق لبداية ونهاية النوبة السلوكية.
   2. قم بمعالجة البيانات عن طريق حساب عدد النوبات المعممة التي لوحظت في 24 ساعة من تسجيلات الفيديو والتعبير عنها من حيث تكرار النوبات ومدتها كقيم متوسطة لجميع النوبات التي لوحظت في 24 ساعة.
   }
   3. تعريف نوبات مخطط كهربية الدماغ على أنها فترات النشاط الانتيابي للتردد العالي (>5 هرتز) تتميز بزيادة السعة بمقدار >3 أضعاف على خط الأساس مع تقدم تردد الارتفاع الذي يستمر لمدة لا تقل عن 3 ثوان أو ما شابه. استخدم برنامج EEG لمعالجة تسجيلات EEG الأولية. قسم آثار مخطط كهربية الدماغ إلى كسور 1 ساعة. انسخ كسور تتبع مخطط كهربية الدماغ إلى ملف لتحليل الارتفاع التلقائي للبرنامج.
   4. تحليل بيانات نشاط مخطط كهربية الدماغ باستخدام برنامج مخطط كهربية الدماغ والمعلمات المحددة مسبقا (4.3.3). قم بإجراء جميع تحليلات الفيديو في اثنين من المحققين المستقلين العمياء عن مجموعة التي تم تحليلها. في حالة الاختلاف ، اجعلهم يعيدون فحص البيانات معا للتوصل إلى توافق في الآراء.

5. غسيل الكلى المجهري

1. في المختبر استعادة المسبار
   1. قم بإعداد المسبار لاستخدامه الأول وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، والتعامل معه في جعبته الواقية.
   2. قم بإجراء التجربة في ثلاث نسخ: قم بإعداد ثلاثة أنابيب اختبار سعة 1.5 مل لتحميلها ب 1 مل من محلول Ringer الذي يحتوي على خليط من المعايير (2.5 ميكرومتر من الغلوتامات و 2.5 ميكرومتر من الأسبارتات). ضع ثلاثة أنابيب اختبار محملة سعة 1.5 مل في سخان الكتلة المضبوطة على 37 درجة مئوية وضعها على أداة التقليب.
      ملاحظة: استخدم نفس الحلول القياسية لمعايرة الكروماتوغرافيا.
   3. أغلق أنابيب الاختبار سعة 1.5 مل بغشاء البارافين واثقبها بملاقط حادة لعمل ثقب يبلغ قطره حوالي 1 مم.
   4. خذ المسبار وأدخله في الفتحة المصنوعة من فيلم البارافين. اغمر الغشاء على الأقل 2 مم تحت مستوى المحلول. قم بتثبيت المسبار إلى أنبوب اختبار 1.5 مل بواسطة فيلم البارافين.
      تنبيه: تأكد من أن الطرف لا يلمس جدران أنبوب الاختبار سعة 1.5 مل.
   5. قم بتوصيل مدخل المسبار بالمحقنة المثبتة على مضخة التسريب باستخدام محولات الإيثيلين بروبيلين المفلور (FEP) - محولات الأنابيب والأنابيب. اختياريا ، استخدم أنابيب البوليثين ذات التجويف الدقيق بقطر داخلي 0.28 مم (ID) وقطر خارجي 0.61 مم (OD) ومحولات أنابيب ملونة (محولات أنابيب حمراء وزرقاء) للتوصيلات.
   6. ابدأ تشغيل المضخة عند 2 ميكرولتر / دقيقة واترك السائل يظهر عند طرف المخرج. قم بتوصيل منفذ المسبار بأنبوب اختبار التجميع 0.2 مل باستخدام محولات أنابيب وأنابيب FEP.
      ملاحظة: استخدم أنابيب FEP لجميع الاتصالات. قص الطول المطلوب للأنبوب باستخدام شفرة حلاقة. استخدم محولات الأنابيب بألوان مختلفة لمدخل ومخرج المسبار. دع المضخة تعمل لمدة 60 دقيقة. تحقق من وجود تسرب وفقاعات هواء. لا ينبغي أن تكون هذه موجودة.
   7. اضبط المضخة على معدل التدفق 2 ميكرولتر / دقيقة وابدأ في جمع العينات على جانب مخرج الأنبوب.
   8. اجمع ثلاث عينات من التبول لمدة 30 دقيقة وثلاث عينات متساوية الحجم من المحلول في أنبوب الاختبار سعة 1.5 مل. خذ عينات متساوية الحجم من أنبوب الاختبار سعة 1.5 مل كل 30 دقيقة باستخدام المحقنة الدقيقة المغمورة في المحلول القياسي في أنبوب الاختبار سعة 1.5 مل.
   9. كرر التجربة (5.1.1-5.1.8) إعداد المضخة على معدل التدفق 3 ميكرولتر / دقيقة (5.1.7) لإجراء مقارنة استرداد المسبار عند استخدام معدلي تدفق نفخ مختلفين.
   10. عند الانتهاء ، أوقف المضخة واشطف الأنبوب بالماء المقطر و 70٪ من الإيثانول وادفع الهواء إليه. قم بتخزين المسبار في قارورة مملوءة بالماء المقطر النظيف. اشطف المسبار جيدا عن طريق نقعه بمعدل 2 ميكرولتر / دقيقة بالماء المقطر قبل التخزين.
   11. تحليل تركيز الغلوتامات والأسبارتات في العينات عن طريق الكروماتوغرافيا.
   12. احسب الاسترداد باستخدام المعادلة التالية:
       الاسترداد (٪) = (C _{التعقيم} / C _{محلول محالة} ) × 100.
2. جلسات غسيل الكلى المجهري في الفئران التي تتحرك بحرية
   1. الإجراءات التحضيرية: إدخال المسبار واختباره ، وإعداد مضخة التسريب وبدء
      1. إعداد مجسات غسيل الكلى المجهري للاستخدام الأول وفقا لدليل المستخدم الخاص بالشركة المصنعة وتعبئتها بمحلول رينجر. قم بقص قطع بطول حوالي 10 سم من أنابيب FEP وتوصيلها بقنيات مدخل ومخرج المسبار باستخدام محولات الأنابيب بألوان مختلفة.
      2. تأكد من أن الأنبوب يلامس المحولات مع عدم وجود مساحة ميتة في جميع التوصيلات.
      3. قبل 24 ساعة من تجربة غسيل الكلى المجهري، قم بتخدير لفترة وجيزة باستخدام الأيزوفلوران (5٪ في الهواء) في غرفة الحث حتى الراقد قم بإزالة القنية الوهمية من دليلها باستخدام الملقط وأمسك رأس بإحكام. أدخل مسبار غسيل الكلى المجهري ، الممنوح بغشاء غسيل الكلى ، في قنية التوجيه وقم بتثبيت قنيات غسيل الكلى المجهري التي تم إدخالها في دليلها عن طريق نمذجة الطين.
         تنبيه: لا تدع المسبار يلمس جدران غلاف المسبار الواقي عند الاستخراج.
      4. ضع في أسطوانة زجاج شبكي ودعه يستكشف الأجواء الجديدة. قم بتوصيل بنظام تسجيل مخطط كهربية الدماغ المربوط كما هو موضح أعلاه (اتبع النقطتين 4.2.2 و 4.2.3).
      5. اتبع حركات الفئران المستيقظة والحركة بحرية وقم بتوصيل مدخل المسبار بحقنة 2.5 مل بإبرة 22G ضعيفة تحتوي على محلول Ringer باستخدام محولات الأنابيب. ادفع محلول Ringer داخل المسبار ، وإخراج 1 مل من محلول Ringer في 10 ثوان ، مع دفع مكبس المحقنة سعة 2.5 مل باستمرار. تحقق من ظهور قطرة السائل على المخرج. المسبار جاهز الآن للاستخدام.
      6. املأ المحاقن سعة 2.5 مل المتصلة بأنابيب FEP بواسطة محولات الأنابيب بمحلول Ringer وقم بتثبيتها على مضخة التسريب. ابدأ تشغيل المضخة عند 2 ميكرولتر / دقيقة. دعها تعمل بين عشية وضحاها.
         ملاحظة: استخدم الطول المطلوب لجميع أنابيب FEP ولكن احسب الحجم الميت للأنبوب لمعرفة متى يجب بدء التحفيز المرتفع K ⁺ وربط بيانات القياس الكمي بالتغيرات الكيميائية العصبية في دماغ. استخدم فقاعة الهواء التي تم إنشاؤها في الأنبوب تحت تدفق العمل لحساب هذه المرة.
   2. جمع العينات أثناء تسجيل مخطط كهربية الدماغ وتحفيز البوتاسيوم
      1. التحقق من عدم وجود نوبات في 3 ساعات تسبق بداية جمع العينات (تسجيلات مخطط كهربية الدماغ بالفيديو) والاستمرار في مراقبة نشاط النوبات أثناء غسيل الكلى المجهري.
      2. أوقف المضخة التي تحمل المحاقن المقنفة بأنابيب FEP المملوءة بمحلول Ringer. قم بتركيب مجموعة أخرى من المحاقن سعة 2.5 مل على المضخة متصلة بأنابيب FEP مع محولات أنابيب مملوءة بمحلول Ringer معدل يحتوي على محلول 100 ملي مولار K⁺.
      3. ابدأ المضخة عند 2 ميكرولتر / دقيقة واتركها تعمل. لملء الأنبوب بشكل أسرع ، اضبط المضخة على 5 ميكرولتر / دقيقة لوقت التعبئة. تحقق من عدم وجود فقاعات هواء في النظام. تأكد من أن الأنبوب يلامس المحولات مع عدم وجود مساحة ميتة في جميع التوصيلات.
      4. اختبر المسبار إذا كان جاهزا للاستخدام في كما هو موضح أعلاه (5-2-1-5).
      5. ملاحظة: إذا لم يعمل المسبار لسبب ما ، فقم بتغييره. في هذه الحالات ، احتفظ بعدد قليل من مجسات غسيل الكلى المجهري المعدة جاهزة للاستخدام بالقرب من محطة عمل غسيل الكلى المجهري. افصل عن كابلات مخطط كهربية الدماغ وقم بتخديره لفترة وجيزة باستخدام الأيزوفلوران إذا لزم الأمر لتحقيق التغيير.
      6. قم بتوصيل أنبوب FEP للمحاقن المملوءة بمحلول Ringer بقنية مدخل المسبار في كل وانتظر ظهور قطرة السائل على طرف المخرج.
      7. قم بتوصيل مخرج المسبار بأنبوب FEP ، مما يؤدي إلى التجميع في أنبوب الاختبار. أدخل أنبوب FEP في أنبوب الاختبار المغلق 0.2 مل بغطاء مثقوب. تأكد من بقاء الأنبوب في مكانه عن طريق التثبيت بقطعة من طين النمذجة.
      8. استمر في تشغيل المضخة بسرعة 2 ميكرولتر / دقيقة لمدة 60 دقيقة دون جمع عينات لموازنة النظام (عينة صفرية).
      9. اجمع 5 عينات متتالية من غسيل الكلى لمدة 30 دقيقة (حجم 60 ميكرولتر على حدة) في ظل ظروف خط الأساس (التروية بمحلول رينجر العادي). تخزين العينات على الثلج.
      10. احسب الوقت الذي يستغرقه السائل للمرور من المضخة إلى رأس (يعتمد ذلك على الحجم الميت للأنبوب ، أي وقت فقاعة الهواء) وقم بتبديل أنبوب FEP الذي ينتقل من المحاقن التي تحتوي على محلول Ringer العادي إلى محاقن تحتوي على محلول Ringer المعدل (100 ملي مولار K ⁺ ) محلول Ringer في هذا الوقت دون إيقاف المضخة. تحقق من عدم وجود فقاعات هواء في النظام. دع المضخة تعمل لمدة 10 دقائق. تنبيه: في غضون 10 دقائق من التحفيز المرتفع K ⁺ ، تميل إلى تحريك نفسها بشكل محموم وعادة ما تقدم عددا كبيرا من اهتزازات الرطبة (السيطرة على العنقودية والخروج منها) أو النوبات السلوكية (الصرع) ، لذا كن مستعدا للتدخل لحماية الأنابيب والكابلات من الالتواء.
      11. بعد 10 دقائق ، قم بتبديل الأنبوب من المحاقن التي تحتوي على 100 ملي مولار K ⁺ محلول Ringer إلى محلول Ringer العادي واترك المضخة تعمل. لا تقم بإيقاف تشغيل المضخة أثناء تغييرات المحلول بحيث يكون هناك قطرة من السائل في نهاية الأنبوب ليتم توصيله في الخط.
      12. من اللحظة التي تحتوي فيها غسيل الكلى على نسبة عالية من البوتاسيوم ، أي بعد جمع غسيل الكلى الخامس بعد التوازن ، اجمع كسور غسيل الكلى كل 10 دقائق (20 ميكرولتر) لمدة 1 ساعة. اجمع 3 عينات إضافية من غسيل الكلى لمدة 30 دقيقة وأوقف المضخة. قم بتخزين العينات على الثلج.
      13. قم بتخزين العينات عند -80 درجة مئوية بعد التجربة حتى تحليل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC).
      14. كرر تجربة غسيل الكلى المجهري لمدة 3 أيام متتالية، باستثناء مجموعة النوبة الحادة (24 ساعة) والأولى التي تتم فيها جلسة غسيل الكلى المجهري واحدة فقط بعد 24 ساعة من النوبة الكلى المجهري أو خلال 24 ساعة بعد أول نوبة تلقائية ( الشكل 3).

النتائج

الشكل 1. التحضير خطوة بخطوة للجهاز المراد زرعه. (A) قطب كهربائي ثلاثي القنوات مع قطب تأريض بطول 10 سم في غلافه الواقي على اليسار وقنية توجيه لغسيل الكلى المجهري على اليمين اللازمة لتجميع الجهاز. (ب). القطب العاري وقنية التوجيه بالتفصيل. تتمثل الخطوة ...

المواد

<فئة الشكل = نمط "الجدول" = 'العرض: 1367pt ؛ '>< فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 3-channel electrode two twistedInvivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USAMS333 / 3-B / SPCMaterialguide cannulaAgn Tho's ، Lindigö ، السويدMAB 4.15.ICMaterialResin KK2 PlastikElettra Sport، Lecco، إيطالياKK2MaterialSuper Attack gel LoctiteHenkel Italia Srl، Milano، Italy2047420_71941MaterialImalgene-KetamineMerial، تولوز، فرنسا221300288 (AIC)الحلXylazineSigma, Milano, ItalyX1251MaterialIsoflurane-VetMerial، تولوز، فرنسا103120022 (AIC)SolutionAltadol 50 ملغ/مل - ترامادولفورمفيت، ميلانو، إيطاليا103703017 (AIC)SolutionGentalyn 0.1٪ crm - gentamycineMSD Italia, Roma, Italy20891077 (AIC) المواد البسيط الأسمنت السريع للأسنانKemdent، Associated Dental Products Ltd، سويندون، المملكة المتحدةACR811MaterialGlasIonomer CX-Plus CementShofu ، كيوتو ، اليابانPN1167الموادحامل مشبك المسبارAgn Tho's ، Lindigö ، السويدp / n 100 5001المعداتHistoacryl® Blue PeachicalSkin Adhesive Seal، آن أربور، ميشيغان، الولايات المتحدة الأمريكيةTS1050044FPالموادالفاليوم 10 ملغ/2 مل - الديازيبامروش، مونزا، إيطاليا019995063 (AIC)المواد1 مل حقنة مع إبرة 25GVetrotecnica، بادوفا، إيطاليا3الموادإبرة تغذية مرنة للفئران 17GAgn Tho's، Lindigö Sweden7206MaterialGrass Technology DeviceGrass Technologies، Natus Neurology Incorporated ، Pleasanton، California، USAM665G08Equipment (مضخم AS40 ، صندوق الرأس ، كابلات التوصيل ، نموذج Telefactor RPSA S40) < td style = 'الارتفاع: 14.5pt ؛'> نظام الحصول على البيانات وتحليلها المعياري MP150Biopac ، Goleta ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةMP150WSWالمعدات < td style = 'الارتفاع: 14.5pt ؛ '> نظام المراقبة بالفيديو الرقميةAverMedia Technologies ، فريمونت ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةV4.7.0041FDالمعدات < td style = 'الارتفاع: 14.5pt ؛' > مسبار غسيل الكلى المجهريAgn Tho's ، Lindigö SwedenMAB 4.15.1.CuMaterial< td style = 'الارتفاع: 14.5pt ؛' > مسبار غسيل الكلى المجهريSynaptech ، كولورادو الينابيع ، كولورادو ، الولايات المتحدة الأمريكيةS-8010Material كتلة سخانGrant Instruments ، كامبريدج ، إنجلتراQBD2Equipment< td style = 'الارتفاع: 14.5pt ؛ '> النمامCecchinato A ، Aparecchi Scientifici ، Mestre ، إيطاليا711Equipment مضخة التسريبUniventor ، Zejtun ، مالطا864المعدات < td style = 'الارتفاع: 14.5pt ؛ ' >أنابيب البوليثين ذات التجويفالناعم سميثس الطبية الدولية المحدودة ، كين ، نيو هامبشاير ، الولايات المتحدة الأمريكية800/100/100/100المواد< نمط td = 'الارتفاع: 14.5pt ؛' >محولات الأنابيب الزرقاء AgnTho's ، Lindigö Sweden1002Materialمحولات الأنابيب الحمراء AgnTho's ، Lindigö Sweden1003Material 2.5 مل حقنة مع إبرة 22GChemil ، Padova ، إيطالياS02G22Material غطاء قارورةCronus ، Labicom ، Olomouc ، جمهورية التشيكVCA-1004TB-100MaterialseptumThermo Scientific ، Rockwoood ، تينيسي ، الولايات المتحدة الأمريكيةالوطنية C4013-60 8 مم TEF / SIL الحاجزالمواد< نمط td = 'الارتفاع: 14.5pt ؛ '> إدراج زجاجي مع زنبرك سفليSupelco ، سيجما ، ميلانو ، إيطاليا27400-UMaterialautosampler vialNational Scientific ، Thermo Fisher Scientific ، Monza ، ItalyC4013-2MaterialSmartline manager 5000 وحدة التحكم في النظام ووحدة degasserKnauer ، برلين ، ألمانياV7602EquipmentSmartline 1000 مضخة التدرج الرباعيKnauer ، برلين ، ألمانياV7603Equipmentتكوين محلول Ringerبالمللي متر: MgCl2 0.85 ، KCl 2.7 ، كلوريد الصوديوم 148 ، CaCl2 1.2 ، 0.3٪ BSA Solution تعديل تكوين محلول Ringerبالملليمتر: MgCl2 0.85 ، KCl 100 ، كلوريد الصوديوم 50.7 ، CaCl2 1.2 ، 0.3٪ BSA Solution محلول ملحي0.9٪ كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة معدلة إلى 7.0 الحل< td style='الارتفاع:14.5pt;'>محلول السكروز10٪ سكروز في محلول الماء المقطر