وضع العلامات المناعية لبروتينات الغشاء العصبي في عينة مكسورة بالتجميد من أنسجة دماغ الفئران

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

وضع العلامات المناعية لبروتينات الغشاء العصبي في عينة مكسورة بالتجميد من أنسجة دماغ الفئران

817 مشاهدة

⸱

أبريل 28, 2025

في هذه المقالة

الملخص

المصدر: Schönherr, S., et. al. الجمع بين الملصقات المناعية المتماثلة للبصريات الوراثية وكسر التجميد لفحص الترتيب الخاص بالمدخلات لمستقبلات الغلوتامات في اللوزة الدماغية في الفأر. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو الملصقات المناعية للنسخ المتماثلة المكسورة بالتجميد من أنسجة دماغ الفئران للفحص المجهري الإلكتروني. يتم هضم النسخ المتماثلة المكسورة والمغلفة لفضح المستقبلات. تتم إضافة الأجسام المضادة الأولية والثانوية ذات العلامات الذهبية لتسمية مستقبلات غشاء عصبي محددة. يتم تثبيت النسخة المتماثلة على شبكة ويتم تصورها تحت المجهر الإلكتروني.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية للحيوانات المناسبة.

1. تحضير العينة

تثبيت الدماغ
1. Preparation of the fixative
  1. للحصول على 1 لتر من المثبت ، قم بوزن 10 جم من البارافورمالدهيد وأضفه إلى 300 مل من الماء منزوع الأيونات (H₂O). يسخن إلى 55 - 60 درجة مئوية لمدة ~ 10 دقائق مع التحريك المستمر.
  2. أطفئي النار وأضيفي 7-8 قطرات من 4 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم (NaOH). يجب أن يصبح الحل واضحا في ~ 10 دقائق.
  3. اتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة أو RT ، أضف 150 مل من محلول مشبع من حمض البيكريك ، واتركه يصل إلى 500 مل مع H₂O منزوع الأيونات.
  4. أضف 500 مل من محلول الفوسفات 0.2 M (PB). الفلترة بورق الترشيح. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم.
  5. قم بتبريد المثبت إلى 6 درجات مئوية ، وقم بتخزينه في عبوات زجاجية داكنة لمدة لا تزيد عن يوم واحد عند 6 درجات مئوية.
2. التروية عبر القلب
  1. تخدير الفئران بحقن داخل الصفاق من ثيوبنتال (120 ملغ/كغ من وزن الجسم). تأكد من تخدير بعمق عن طريق فحص منعكس سحب الدواسة ، والذي يجب أن يكون غائبا. ضع على ظهره على طاولة التروية مع ربط الأطراف الأربعة.
  2. افتح جدار البطن طوليا بمقص حاد وقم بعمل قطعتين إضافيتين بشكل جانبي على طول الحدود الذيلية للقفص الصدري لكشف الحجاب الحاجز. اقطع الحجاب الحاجز وقطع الجدار الصدري عند الحدود العظمية الغضروفية على كلا الجانبين. ارفع الطرف الذيلي للبلاطة المركزية للجدار الصدري الذي يحتوي على القص لكشف القلب.
  3. قم بإزالة التامور وقم بعمل قطع صغير ودقيق في طرف البطين الأيسر للدخول إلى قنية جهاز التروية. استخدم قنية حادة بقطر داخلي يبلغ 0.6 مم. مرر القنية برفق عبر البطين حتى يظهر الطرف في الشريان الأورطي الصاعد ، وقم بتأمين القنية بمشبك. للسماح للدم والخريد بالخروج من مجرى الدم ، قم بعمل قطع في الأذين الأيمن.
  4. قم بتصريف الفئران عبر القلب باستخدام مضخة تمعجية بمعدل تدفق 5 مل / دقيقة في البداية مع محلول ملحي عازل للفوسفات أو PBS (25 ملي مولار ، 0.9٪ كلوريد الصوديوم أو كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.4) لمدة دقيقة واحدة تقريبا ، متبوعا بمثبت مبرد بالثلج لمدة 7 دقائق.
  5. بعد التثبيت ، قم بقطع رأس الماوس بمقص ثم قم بقص الجلد عبر خط الوسط من الرقبة إلى الأنف. قم بإزالة العضلات لكشف الجمجمة بالكامل.
  6. باستخدام مقص حاد ، قم بعمل قطع طولي من خلال العظام القذالية والجدارية بدءا من الثقبة العظمية. باستخدام ملاقط دقيقة ، قم بإزالة هذه العظام لكشف المخيخ بأكمله. ثم قم بعمل قطع طولي آخر من خلال العظام الجدارية والأمامية حتى عظم الأنف وإزالتها بالملاقط لكشف الدماغ كله.
  7. باستخدام ملعقة ، قم بإزالة الدماغ دون إتلافه وضعه في درجة حرارة مثلجة 0.1 M PB.
تقسيم وتشذيب العينات
1. cut كتلة إكليلية من 5-6 مم تقريبا بشفرات حلاقة تحتوي على منطقة الاهتمام. قم بلصقه على حامل آلة التقطيع الاهتزازية بغراء سيانواكريلات. قم بتوجيه كتلة الأنسجة بحيث تواجه القشرة المخية الحديثة الشفرة الاهتزازية. قم بتقطيع الأقسام الإكليلية التي تحتوي على اللوزة الدماغية على ارتفاع 140 ميكرومتر باستخدام آلة التقطيع الاهتزازية (الشكل 1 أ) في درجة حرارة ثلجية 0.1 M PB واجمعها في طبق مكون من 6 آبار في نفس المخزن المؤقت.
2. تحت المجهر المجسم ، قم بقص المنطقة محل الاهتمام (هنا ، الكتلة المجاورة الظهرية المتوسطة لكتل الخلايا المقسمة للوزة الدماغية أو ITC ؛ انظر الشكل 1 ب) من الشريحة. افعل ذلك في طبق بتري مغطى بمطاط من السيليكون ومليء ب 0.1 M PB ، باستخدام مشرط للعيون. تأكد من أن الكتل المشذبة تتناسب مع فتحة الفاصل (حوالي 1.5 مم) (الشكل 1 ب).
3. انقل الكتل المشذبة إلى محلول الحماية بالتبريد (30٪ جلسرين في 0.1 M PB) طوال الليل (O / N) عند 6 درجات مئوية.

2. التجميد عالي الضغط

NOTE: يتكون وضع العلامات المناعية المتماثلة لكسر التجميد (FRIL) من 6 خطوات أساسية (الشكل 2): 1) التجميد السريع بضغط عال (عند 2,300 - 2,600 بار) للعينة. 2) تكسير العينة. يتبع مستوى الكسر بشكل عام النواة المركزية الكارهة للماء للأغشية المجمدة ، وتقسيمها إلى وريقتين نصف غشاء: نصف يقع بجوار البروتوبلازم (P-face) ونصف يقع بجوار الفضاء خارج الخلية أو خارج المجموعة (E-face). 3) تكرار العينة عن طريق الترسب الفراغي للبلاتين والكربون. 4) هضم المنظفات للأنسجة. 5) وضع العلامات على Immunogold. 6) تحليل النسخة المتماثلة باستخدام مجهر إلكتروني ناقل الحركة.

تحضير ناقلات النحاس
ملاحظة: ليتم التعامل معها خلال المراحل المتتالية من إجراء FRIL ، يجب تركيب العينات على ناقلات معدنية (ذهبية أو نحاسية). تختلف هذه الناقلات في الحجم والتصميم وفقا لطريقة التكسير ونوع الآلات المستخدمة. هنا ، استخدمنا ناقلات نحاسية (الشكل 1 ب ، ه) و "جدول النسخ المتماثلة المزدوجة" المفصلي (انظر الشكل 3 ب) ، والذي ، عند فتحه ، ينتج عنه كسر شد من خلال العينة المجمدة (الشكل 2). هذا يسمح بالاحتفاظ بجانبي العينة المكسورة وتكرارهما.
1. ناقلات النحاس البولندية مع مزيل تشويه باستخدام ورقة من جلد الشامواه.
2. ضع الناقلات في وعاء زجاجي ونظفها مرتين باستخدام منظف غير أيوني (درجة الحموضة ~ 1.5) في حمام مائي صوتنة ، ثم اغسلها على نطاق واسع في ماء الصنبور متبوعا بالماء منزوع الأيونات ، ثم اشطفها مرتين بالإيثانول.
3. صوتنة ناقلات النحاس في الأسيتون لمدة 15 دقيقة.
4. ضع الناقلات على ورق الترشيح حتى تجف.
5. قم بإرفاق حلقة من الشريط على الوجهين بحامل نحاسي (الشكل 1C) ، والذي سيكون بمثابة بئر تثبيت للكتلة المشذبة (حامل القابضة).
تجميد العينة
ملاحظة: تعامل مع النيتروجين السائل بعناية وارتداء النظارات الواقية المناسبة.
1. قم بتشغيل وحدة التجميد ذات الضغط العالي (الشكل 1F) لمدة 1.5 ساعة على الأقل قبل تجميد العينة.
2. ابدأ التسخين بالضغط على زر "AIR HEATER" ، واخبزيه لمدة 50 دقيقة. اضبط درجة حرارة الهواء على 80 درجة مئوية.
3. قم بتوصيل خزان النيتروجين بوحدة التجميد ذات الضغط العالي واضغط على زر "NITROGEN" لملء Dewar الداخلي بالنيتروجين السائل. يضيء مصباح "مستوى النيتروجين". ابدأ التبريد بالضغط على زر "التبريد".
4. اضغط على زر "DRIVE IN" عند خروج "مستوى النيتروجين". تأكد من أن النظام الهيدروليكي يحرك المكبس ذهابا وإيابا 3 مرات.
5. اضغط على الزر "AUTO" وزر "NITROGEN". بمجرد أن تضيء "READY" ، تكون وحدة التجميد ذات الضغط العالي جاهزة للتجميد بالضغط العالي.
6. ضع كتلة مشذبة في فتحة الشريط على الوجهين (الشكل 1 ب) باستخدام حلقة سلكية من البلاتين تم صهرها في ماصة زجاجية.
7. قم بإزالة الفائض من محلول التجميل بالتبريد باستخدام ورق ترشيح أو فرشاة.
  ملاحظة: هذا الإجراء مهم أيضا لإزالة فقاعات الهواء التي قد تتشكل حول الأنسجة والتي يمكن أن تسبب تشويها في شكل الأنسجة و / أو البنية الفوقية.
8. تحت المجهر المجسم ، قم بتغطية الحامل القابض بحامل آخر ، بحيث يتم وضع كتلة الأنسجة بين الناقلين.
9. أدخل شطيرة الحامل في حامل عينة وحدة التجميد عالية الضغط (الشكل 1 د). أدخل حامل العينة في وحدة التجميد ذات الضغط العالي (الرأس لأسفل) وقم بتثبيته عن طريق شد حامل العينة.
10. ابدأ دورة التجميد بالضغط على زر "Jet-Auto". العمل في أسرع وقت ممكن ، قم بإزالة حامل العينة وغمر الطرف بالنيتروجين السائل في صندوق معزول. اغمر أطراف زوجين من الملقط في النيتروجين السائل لتبريدها.
11. قم بإزالة شطيرة الحامل بعناية من حامل العينة وضعها في كريوفيال مبرد مسبقا. تأكد من التعامل مع الناقلات فقط باستخدام ملقط مبرد بالنيتروجين السائل. يجب ثقب المبردات للسماح للنيتروجين بالتدفق من القارورة (الشكل 1 ز).
12. كرر الخطوات من 2.2.6 إلى 2.2.11 حتى يتم تجميد جميع العينات المطلوبة. يمكن تخزين شطائر متعددة تحتوي على نفس النوع من العينة في نفس القارورة.
13. قم بتخزين المواد المبردة التي تحتوي على الناقلات في خزان التبريد حتى النسخ المتماثل (الشكل 1H).

3. التجميد والكسر والنسخ المتماثل

تحضير مسدسات شعاع الإلكترون
1. قبل إدخال مسدسات شعاع الإلكترون ، قم بإزالة الدرع ب "لوحة العاكس". ضع "مقياس الإعداد" لتوسيط الفتيل في ظرف الكوليت من خلال غطاء الكاثود السفلي.
  ملاحظة: يتم استخدام نهاية القطر الأكبر لمقياس الإعداد لمسدس الكربون ، في حين أن نهاية القطر الأصغر مخصصة للمسدس البلاتيني.
2. حرك الفتيل الجديد فوق المقياس حتى تتمكن "صفائح الضغط" من تثبيت نهايات الفتيل ، مما يضمن عدم وضع ملف الفتيل بزاوية.
3. قم بإزالة مقياس الإعداد وأدخل قضيب الكربون. قم بإصلاحه عن طريق شد ظرف كوليت حامل قضيب المبخر ، مع التأكد من أن ارتفاع نهاية القضيب في منتصف الملف الثاني من الأسفل. بالنسبة للمسدس البلاتيني ، يجب أن يكون ارتفاع نهاية قضيب البلاتين في منتصف ملف الفتيل الثاني من الأعلى.
4. استبدل لوحة العاكس وأدخل المسدسات في وحدة كسر التجميد. نظف البنادق باستخدام مكبر الرمل بعد الاستخدام.
قم بإعداد وحدة كسر التجميد
1. قم بتشغيل وحدة كسر التجميد (الشكل 3 أ) عن طريق تحويل MAINS إلى 1. للحصول على وصف تفصيلي لإجراءات التجميد والكسر والنسخ المتماثل ، راجع تعليمات التشغيل المقدمة من الشركة المصنعة.
2. قبل تبريد جهاز الكسر بالتجميد ، اخبز نظام التبريد بالكامل للوحدة بالهواء الدافئ. اضغط على زر "الذوبان" في جهاز MTC 010 (وحدة التحكم في درجة الحرارة) (الشكل 3 أ) واترك عملية الخبز تعمل لمدة 45 دقيقة.
3. قم بتنشيط محطة التفريغ. تعمل وحدة التجميد والكسر عادة في نطاق فراغ ~ ^10-6- ^10-7 ملي بار.
4. املأ خزان النيتروجين وقم بتوصيله بوحدة كسر التجميد. تأكد من جفاف حامل الصمام وقم أيضا بتنظيف مدخل الخزان قبل إدخال حامل الصمام (يمكن أن تتداخل الرطوبة مع الفراغ والإشارة إلى ملء N₂ للخزان).
5. ابدأ التبريد عن طريق ضبط درجة الحرارة على -115 درجة مئوية. يستغرق التبريد حوالي 45 دقيقة.
6. أدخل مسدسات شعاع الإلكترون واضبط التيار والجهد للوصول إلى المعلمات التالية للتبخر:
  مسدس الكربون: الدوران ، الموضع 90 درجة ، معدل تراكم الكربون 0.1 - 0.2 نانومتر / ثانية
  مسدس الكربون البلاتيني: إيقاف الدوران ، الموضع 60 درجة ، معدل التراكم 0.06 - 0.1 نانومتر / ثانية
  ملاحظة: إذا تم استخدام مسدس لأول مرة بعد تبادل قضيب الكربون أو البلاتين ، ديغا لمدة 3 دقائق قبل الاستخدام.
التكسير والنسخ المتماثل
1. أدخل شطائر الناقل المجمدة في جدول نسخ متماثل مزدوج مع التأكد من أن جميع التلاعبات تتم بالنيتروجين السائل.
2. انقل جدول النسخ المتماثلة المزدوج إلى سفينة ديوار وقم بإصلاحه في مستقبل مرحلة العينة بزاوية 45 درجة. يجب أن يكون مستوى النيتروجين السائل دائما فوق جدول النسخ المتماثلة المزدوجة.
3. التقط طاولة النسخ المتماثلة المزدوجة باستخدام مناور الطاولة وأدخلها في وحدة كسر التجميد على المرحلة الباردة. انتظر حوالي 20 دقيقة للسماح بضبط درجة حرارة جدول النسخ المتماثلة المزدوجة على -115 درجة مئوية.
4. تأكد من أن الفراغ أقل من ^10-6 ملي بار وأن درجة الحرارة -115 درجة مئوية.
5. كسر الأنسجة عن طريق الدوران اليدوي عكس اتجاه عقارب الساعة للعجلة المتصلة بالكفن الموضوع فوق طاولة النسخ المتماثلة المزدوجة. عندما يتحول الكفن ، فإنه يجبر طاولة النسخ المتماثلة المزدوجة على الفتح ، مما يؤدي إلى تكسير الأنسجة.
6. اضغط على زر "التوتر العالي" في جهاز EVM 030 (وحدة التحكم في تبخر شعاع الإلكترون) لوحدة كسر التجميد (الشكل 3 أ).
7. بتكرار الأسطح المكشوفة للأنسجة المكسورة (الشكل 3C) عن طريق تبخر الكربون (الدوران) عن طريق مسدس شعاع إلكتروني موضوعة بزاوية 90 درجة بسمك 5 نانومتر ، متبوعا بتظليل أحادي الاتجاه بالكربون البلاتيني بزاوية 60 درجة إلى سمك 2 نانومتر. أخيرا ، ضع طبقة من الكربون بسمك 15 نانومتر بزاوية 90 درجة (دورة).
8. استخدم المعلمات التالية للتبخر:
  1st carbon: الدوران ، الموضع 90 درجة ؛ السرعة 0.1 - 0.2 نانومتر / ثانية ؛ 5 نانومتر
  2nd الكربون والبلاتين: الموضع 60 درجة ؛ السرعة 0.06 - 0.1 نانومتر / ثانية ؛ 2 نانومتر
  الكربون الثالث: الدوران ، الموضع 90 درجة ؛ السرعة 0.3 - 0.5 نانومتر / ثانية ؛ 15 نانومتر
9. قم بإزالة العينات المكررة من وحدة كسر التجميد وانقلها إلى صفيحة خزفية مكونة من 12 بئرا (الشكل 4 أ) مملوءة ب TBS ( محلول ملحي مخزن في تريس ، درجة الحموضة 7.4).
10. باستخدام قضيب سلكي ذو حلقة بلاتينية ، قم بإزالة الأنسجة المكررة من حامل العينة (الشكل 4 أ).
11. كرر الخطوات من 3.3.1 إلى 3.3.10 حتى يتم نسخ جميع العينات.
4. SDS-digest للنسخة المتماثلة
1. انقل النسخة المتماثلة إلى قارورة زجاجية سعة 4 مل مملوءة ب 1 مل من المخزن المؤقت للهضم SDS (2.5٪ كبريتات لوريل الصوديوم ، 20٪ سكروز في 15 ملي مولار تريس ، درجة الحموضة 8.3). يخص لمدة 18 ساعة عند 80 درجة مئوية مع الرج (45 ضربة / دقيقة).
2. انقل النسخ المتماثلة إلى أنبوب جديد مملوء بمخزن مؤقت لهضم SDS وقم بتخزينه في RT.

4. Immunolabeling

NOTE: يتم إجراء جميع الحضانات في RT مع اهتزاز لطيف باستثناء الحضانات مع الأجسام المضادة.

اغسل النسخة المتماثلة لمدة 10 دقائق في محلول هضم كبريتات دوديسيل الصوديوم الطازجة (SDS).
اغسل النسخة المتماثلة مرة واحدة باستخدام 2.5٪ BSA (ألبومين مصل الأبقار) في محلول ملحي ثلاثي أو TBS لمدة 5 دقائق ، ثم 3 × 10 دقائق مع 0.1٪ BSA في TBS.
حظر مواقع الربط غير المحددة في TBS مع 5٪ BSA لمدة 1 ساعة.
تطبيق الأجسام المضادة الأولية المخففة في 2٪ BSA-TBS. قم بإجراء الحضانات في قطرة 30 ميكرولتر (الشكل 4 ب) في غرفة رطبة عند 15 درجة مئوية لمدة 72 ساعة (الشكل 4 ج).
1. في هذه الدراسة، قم بمعالجة كلتا النسختين المتماثلتين من الأنسجة المكسورة. احتضان نسخة طبق الأصل واحدة مع جسم مضاد متعدد النسيلة لخنزير غينيا مرفوعا ضد الأحماض الأمينية 717-754 من الفأر GluR1 المشترك في جميع مستقبلات حمض α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic أو الوحدات الفرعية AMPA-R (التخفيف: 1:200) أو جسم مضاد أحادي النسيلة للفأر مرفوع ضد بروتين اندماج مؤتلف يغطي الأحماض الأمينية 660-811 من الوحدة الفرعية NR1 لمستقبلات N-Methyl-D-Aspartate أو NMDA-R (التخفيف: 1: 500) ، وجسم مضاد متعدد النسيلة للأرانب مرفوعة ضد البروتين الفلوري الأخضر (التخفيف: 1: 300).
2. احتضان النسخة المتماثلة الأخرى بجسم مضاد متعدد النسيلة للأرانب مرفوعة ضد ببتيد اصطناعي يتوافق مع الأحماض الأمينية 384-398 من مستقبلات μ الأفيونية للفئران (التخفيف: 1: 500).
يغسل في TBS مع 0.05٪ BSA (3 × 5 دقائق).
تطبيق الأجسام المضادة الثانوية. في هذه الدراسة ، استخدم الذهب (5 نانومتر لمستقبلات الغلوتامات المؤثرة للأيونات ، و 10 لمستقبلات μ الأفيونية ، و / أو 15 نانومتر لبروتين الفلورسنت الأصفر Channelrhodopsin-2 أو ChR2-YFP) الأجسام المضادة المترافقة المخففة في TBS مع 2٪ BSA. تمييع الأجسام المضادة الثانوية 1:30 وتحتضن في انخفاض 30 ميكرولتر عند 15 درجة مئوية O / N.
اغسل 3 × 5 دقائق في 0.05٪ BSA-TBS في RT.
يغسل 2 × 5 دقائق في ماء فائق النقاء.
قم بتركيب نسخة طبق الأصل على شبكة قضيب متوازية من 100 سطر مطلية بالفورمفار (الشكل 4 د).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الشكل 1. تحضير الأنسجة والتجميد بالضغط العالي. ( أ) يستخدم الاهتزاز لتقسيم الأنسجة. (B) يظهر قسم دماغ الفأر الإكليلي الناتج الذي يحتوي على اللوزة جنبا إلى جنب مع حامل نحاسي مزود بحلقة من الشريط على الوجهين....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

< فئة الشكل = نمط الجدول = 'العرض: 470 نقطة ؛ '><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Tissue preparationParaformaldehyde EM gradeAgar Scientific Ltd., United KingdomAGR1018محلول حمض البيكريك المشبعSigma-Aldrich, USAP6744-1GANa2HPO4-2H20Merck Millipore, Germany1065860500NaH2PO4-2H2OMerck Millipore, Germany1063451000< td style='height:: 14.5pt ؛ العرض: 153pt ؛ '>NaCl < td style = 'width: 164pt ؛ '>Merck Millipore ، ألمانيا < td style = 'width: 153pt ؛ '>1064041000 < td style = 'height: 14.5pt ؛ width: 153pt ؛ '> 4N NaOH < td style = 'width: 164pt ؛ '>Carl Roth ، ألمانيا < td style = 'width: 153pt ؛ '>T198.1 < td style = 'height: 14.5pt ؛ width: 153pt ؛ '>Thiopental < td style = 'width: 164pt ؛ '>Sandoz ، النمسا < td style = 'width: 153pt ؛ '>5,133GlycerolSigma-Aldrich, USAG5516-500MLGenPure Ultra-Pure water systemThermo Fisher Scientific, USA50131235pump peristaltic selfISMATEC, Germany< td style='width:153pt;'>ISM 930CFilter PaperMACHEREY-NAGEL, GermanyMN 615 1/4Vibroslicer, VT1000SLeica Microsystems, Austria Ophthalmic ScalpelAlcon Laboratories, USA Perfusion cannulaVieweg, GermanyF560088-1High-pressure FreezingBrass carriersEngineering Office M. Wohlwend، CH528Sidol البولنديةHenkel, Germany Chamois skinHousehold supply store ثقب لكمة، 1,5mmStubai, Austria detord ethanolDonauchem, Austria AcetoneRoth, Germany9372.5High Pressure Frozen Machine HPM 010BalTec, CH; now Leica MicrosystemsHPM010< td style='height:: 15.75pt ؛ العرض : 153pt ؛ '>المجهر المجسم < td style = 'العرض: 164pt ؛ '> أوليمبوس ، اليابان < td style = 'العرض: 153pt ؛ '>SZX10 < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 153pt ؛ '> النيتروجين السائل < td style = 'العرض: 164pt ؛ '> < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 153pt ؛ '>Cryo-vials < td style = 'width: 164pt ؛ '>Roth ، ألمانيا < td style = 'width: 153pt ؛ '>E309.1< td style='height:: 15.75pt ؛ العرض : 153pt ؛ '>CryoCane < td style = 'width: 164pt ؛ '>Nalge Nunc International ، الولايات المتحدة الأمريكية < td style = 'العرض: 153pt ؛ '> 5015-0001 < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 153pt ؛ '>CryoSleeve < td style = 'width: 164pt ؛ '>Nalge Nunc International ، الولايات المتحدة الأمريكية < td style = 'العرض: 153pt ؛ '> 5016-0001 < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 153pt ؛ '>وعاء تخزين النيتروجين السائل < td style = 'width: 164pt ؛ '> Cryopal ، فرنسا< td style='width:153pt;'>GT38المنظفات غير الأيونية (Lavocid)Werner & Mertz Professional, Germany Freeze-fracture and ReplicationSandblaster, Mikromat 200-1JOKE Joisten & Kettenbaum, GermanySANDURET 2- KSiliciumcarbid SIC 360 ، حجم الحبوب 25 - 21μ < td style = 'width: 164pt ؛ '>JOKE Joisten & Kettenbaum ، ألمانيا < td style = 'width: 153pt ؛ '>955932 تجميد نظام كسر BAF 060 < td style = 'width: 164pt ؛ '>BalTec ، CH ؛ الآن Leica Microsystems < td style = 'width: 153pt ؛ '>BAF060 < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 153pt ؛ '> Ceramic 12 well plate < td style = 'width: 164pt ؛ ' >Gröpel ، النمسا < td style = 'width: 153pt;'>14511Trizma baseSIGMA USAT1503Trizma hydrochlorideSIGMA USAT3253Sodium كلوريد الصوديومMerck, ألمانيا< td style='width:153pt;'>1,06,40،41،000SDS, كبريتات لوريل الصوديومRoth, Germany5136.1SucroseMerc, Germany1,07,68,71,000TRISRoth, ألمانيا < td style = 'width: 153pt ؛ '> 5429.3 < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 153pt ؛ '>Universal Hybridization Oven < td style = 'width: 164pt ؛ '>Binder ، ألمانيا < td style = 'width: 153pt ؛ '>7001-0050 < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 470pt ؛ ' colspan = '3'> Immunolabelling < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 153pt ؛ '>BSA < td style = 'width: 164pt ؛ '>SIGMA ، الولايات المتحدة الأمريكية < td style = 'width: 153pt ؛ '> A9647< td style='الارتفاع:15.75pt;; العرض: 153pt ؛ '>Antibody Antibody < td style = 'width: 164pt ؛ '> Molecular Probes ، الولايات المتحدة الأمريكية < td style = 'العرض: 153pt ؛ '>A11122 < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 153pt ؛ '>Anti-pan-AMPAR Antibody < td style = 'width: 164pt ؛ '>Frontier Institute ، اليابان < td style = 'width: 153pt ؛ '>pan AMPAR-GP-Af580-1 < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 153pt ؛ '> Anti-NMDAR1 Antibody ، استنساخ 54.1 < td style = 'width: 164pt ؛ '>Merck Millipore ، ألمانياMAB363Opioid Receptor-Mu (MOR) AntibodyImmunoStar, USA24216EM goat anti-guinea pig, 5nm; secondary antibodyBBInternational,EM. نمط GAG5EM الماعز المضاد للأرانب ، 15 نانومتر ؛ الجسم المضاد الثانوي < نمط TD = 'العرض: 164pt ؛ '>BBInternational ، < td style = 'width: 153pt ؛ '>EM. GAR15الحمار المضاد للأرانب ، 10 نانومتر ، الجسم المضاد الثانوي < نمط td = 'العرض: 164pt ؛ '>AURION ، هولندا < td style = 'العرض: 153pt ؛ '>DAR 10nm < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 153pt ؛ '>شبكات نحاسية ، 100 شريط متوازي < td style = 'width: 164pt ؛ '>Agar Scientific ، UK< td style = 'width: 153pt ؛ '>G2012C < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: '>Incubatormajor العلوم ، الولايات المتحدة الأمريكية < td style = 'العرض: 153pt ؛ '>MO-RC < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 153pt ؛ '> مسحوق Pioloform < td style = 'العرض: 164pt ؛ '>Agar Scientific ، المملكة المتحدة < td style = 'العرض: 153pt ؛ '>R1275 < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 153pt ؛ '>ChloroformRoth ، ألمانيا < td style = 'width: 153pt ؛ '> 3313.1

الوسوم

تقنية تكرار الكسر بالتجميد تقنية الوسم المناعي طلاء البلاتين والكربون محلول منظم لهضم SDS أجسام مضادة مقترنة بالذهب المجهر الإلكتروني النافذ شبكة مطلية بـ Formvar أجسام مضادة أولية وثانوية