وضع العلامات المناعية لبروتينات الغشاء العصبي في عينة مكسورة بالتجميد من أنسجة دماغ الفئران

الملخص

المصدر: Schönherr, S., et. al. الجمع بين الملصقات المناعية المتماثلة للبصريات الوراثية وكسر التجميد لفحص الترتيب الخاص بالمدخلات لمستقبلات الغلوتامات في اللوزة الدماغية في الفأر. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو الملصقات المناعية للنسخ المتماثلة المكسورة بالتجميد من أنسجة دماغ الفئران للفحص المجهري الإلكتروني. يتم هضم النسخ المتماثلة المكسورة والمغلفة لفضح المستقبلات. تتم إضافة الأجسام المضادة الأولية والثانوية ذات العلامات الذهبية لتسمية مستقبلات غشاء عصبي محددة. يتم تثبيت النسخة المتماثلة على شبكة ويتم تصورها تحت المجهر الإلكتروني.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية للحيوانات المناسبة.

1. تحضير العينة

1. تثبيت الدماغ
   1. Preparation of the fixative
      1. للحصول على 1 لتر من المثبت ، قم بوزن 10 جم من البارافورمالدهيد وأضفه إلى 300 مل من الماء منزوع الأيونات (H₂O). يسخن إلى 55 - 60 درجة مئوية لمدة ~ 10 دقائق مع التحريك المستمر.
      2. أطفئي النار وأضيفي 7-8 قطرات من 4 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم (NaOH). يجب أن يصبح الحل واضحا في ~ 10 دقائق.
      3. اتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة أو RT ، أضف 150 مل من محلول مشبع من حم....

النتائج

الشكل 1. تحضير الأنسجة والتجميد بالضغط العالي. ( أ) يستخدم الاهتزاز لتقسيم الأنسجة. (B) يظهر قسم دماغ الفأر الإكليلي الناتج الذي يحتوي على اللوزة جنبا إلى جنب مع حامل نحاسي مزود بحلقة من الشريط على الوجهين........

المواد

< فئة الشكل = نمط الجدول = 'العرض: 470 نقطة ؛ '><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Tissue preparationParaformaldehyde EM gradeAgar Scientific Ltd., United KingdomAGR1018محلول حمض البيكريك المشبعSigma-Aldrich, USAP6744-1GANa2HPO4-2H20Merck Millipore, Germany1065860500NaH2PO4-2H2OMerck Millipore, Germany1063451000< td style='height:: 14.5pt ؛ العرض: 153pt ؛ '>NaCl < td style = 'width: 164pt ؛ '>Merck Millipore ، ألمانيا < td style = 'width: 153pt ؛ '>1064041000 < td style = 'height: 14.5pt ؛ width: 153pt ؛ '> 4N NaOH < td style = 'width: 164pt ؛ '>Carl Roth ، ألمانيا < td style = 'width: 153pt ؛ '>T198.1 < td style = 'height: 14.5pt ؛ width: 153pt ؛ '>Thiopental < td style = 'width: 164pt ؛ '>Sandoz ، النمسا < td style = 'width: 153pt ؛ '>5,133GlycerolSigma-Aldrich, USAG5516-500MLGenPure Ultra-Pure water systemThermo Fisher Scientific, USA50131235pump peristaltic selfISMATEC, Germany< td style='width:153pt;'>ISM 930CFilter PaperMACHEREY-NAGEL, GermanyMN 615 1/4Vibroslicer, VT1000SLeica Microsystems, Austria Ophthalmic ScalpelAlcon Laboratories, USA Perfusion cannulaVieweg, GermanyF560088-1High-pressure FreezingBrass carriersEngineering Office M. Wohlwend، CH528Sidol البولنديةHenkel, Germany Chamois skinHousehold supply store ثقب لكمة، 1,5mmStubai, Austria detord ethanolDonauchem, Austria AcetoneRoth, Germany9372.5High Pressure Frozen Machine HPM 010BalTec, CH; now Leica MicrosystemsHPM010< td style='height:: 15.75pt ؛ العرض : 153pt ؛ '>المجهر المجسم < td style = 'العرض: 164pt ؛ '> أوليمبوس ، اليابان < td style = 'العرض: 153pt ؛ '>SZX10 < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 153pt ؛ '> النيتروجين السائل < td style = 'العرض: 164pt ؛ '> < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 153pt ؛ '>Cryo-vials < td style = 'width: 164pt ؛ '>Roth ، ألمانيا < td style = 'width: 153pt ؛ '>E309.1< td style='height:: 15.75pt ؛ العرض : 153pt ؛ '>CryoCane < td style = 'width: 164pt ؛ '>Nalge Nunc International ، الولايات المتحدة الأمريكية < td style = 'العرض: 153pt ؛ '> 5015-0001 < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 153pt ؛ '>CryoSleeve < td style = 'width: 164pt ؛ '>Nalge Nunc International ، الولايات المتحدة الأمريكية < td style = 'العرض: 153pt ؛ '> 5016-0001 < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 153pt ؛ '>وعاء تخزين النيتروجين السائل < td style = 'width: 164pt ؛ '> Cryopal ، فرنسا< td style='width:153pt;'>GT38المنظفات غير الأيونية (Lavocid)Werner & Mertz Professional, Germany Freeze-fracture and ReplicationSandblaster, Mikromat 200-1JOKE Joisten & Kettenbaum, GermanySANDURET 2- KSiliciumcarbid SIC 360 ، حجم الحبوب 25 - 21μ < td style = 'width: 164pt ؛ '>JOKE Joisten & Kettenbaum ، ألمانيا < td style = 'width: 153pt ؛ '>955932 تجميد نظام كسر BAF 060 < td style = 'width: 164pt ؛ '>BalTec ، CH ؛ الآن Leica Microsystems < td style = 'width: 153pt ؛ '>BAF060 < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 153pt ؛ '> Ceramic 12 well plate < td style = 'width: 164pt ؛ ' >Gröpel ، النمسا < td style = 'width: 153pt;'>14511Trizma baseSIGMA USAT1503Trizma hydrochlorideSIGMA USAT3253Sodium كلوريد الصوديومMerck, ألمانيا< td style='width:153pt;'>1,06,40،41،000SDS, كبريتات لوريل الصوديومRoth, Germany5136.1SucroseMerc, Germany1,07,68,71,000TRISRoth, ألمانيا < td style = 'width: 153pt ؛ '> 5429.3 < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 153pt ؛ '>Universal Hybridization Oven < td style = 'width: 164pt ؛ '>Binder ، ألمانيا < td style = 'width: 153pt ؛ '>7001-0050 < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 470pt ؛ ' colspan = '3'> Immunolabelling < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 153pt ؛ '>BSA < td style = 'width: 164pt ؛ '>SIGMA ، الولايات المتحدة الأمريكية < td style = 'width: 153pt ؛ '> A9647< td style='الارتفاع:15.75pt;; العرض: 153pt ؛ '>Antibody Antibody < td style = 'width: 164pt ؛ '> Molecular Probes ، الولايات المتحدة الأمريكية < td style = 'العرض: 153pt ؛ '>A11122 < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 153pt ؛ '>Anti-pan-AMPAR Antibody < td style = 'width: 164pt ؛ '>Frontier Institute ، اليابان < td style = 'width: 153pt ؛ '>pan AMPAR-GP-Af580-1 < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 153pt ؛ '> Anti-NMDAR1 Antibody ، استنساخ 54.1 < td style = 'width: 164pt ؛ '>Merck Millipore ، ألمانياMAB363Opioid Receptor-Mu (MOR) AntibodyImmunoStar, USA24216EM goat anti-guinea pig, 5nm; secondary antibodyBBInternational,EM. نمط GAG5EM الماعز المضاد للأرانب ، 15 نانومتر ؛ الجسم المضاد الثانوي < نمط TD = 'العرض: 164pt ؛ '>BBInternational ، < td style = 'width: 153pt ؛ '>EM. GAR15الحمار المضاد للأرانب ، 10 نانومتر ، الجسم المضاد الثانوي < نمط td = 'العرض: 164pt ؛ '>AURION ، هولندا < td style = 'العرض: 153pt ؛ '>DAR 10nm < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 153pt ؛ '>شبكات نحاسية ، 100 شريط متوازي < td style = 'width: 164pt ؛ '>Agar Scientific ، UK< td style = 'width: 153pt ؛ '>G2012C < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: '>Incubatormajor العلوم ، الولايات المتحدة الأمريكية < td style = 'العرض: 153pt ؛ '>MO-RC < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 153pt ؛ '> مسحوق Pioloform < td style = 'العرض: 164pt ؛ '>Agar Scientific ، المملكة المتحدة < td style = 'العرض: 153pt ؛ '>R1275 < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 153pt ؛ '>ChloroformRoth ، ألمانيا < td style = 'width: 153pt ؛ '> 3313.1