تصوير التحجم المتزامن وتسجيل تخطيط كهربية العضل في نموذج فأر ALS

الملخص

المصدر: Jensen, V. N., et al. القياس المتكرر لنشاط عضلات الجهاز التنفسي والتهوية في نماذج الفئران للأمراض العصبية العضلية. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو طريقة تسجيل إشارات التحجم المتزامن وتخطيط كهربية العضل في نموذج فأر ALS يتحرك بحرية. يتضمن الإجراء استخدام أقطاب كهربائية مزروعة وجهاز إرسال لالتقاط نشاط العضلات ، جنبا إلى جنب مع غرفة تخطيط التحجم لمراقبة أنماط التنفس ، للتحقيق في دور العضلات الملحقة في فأر التصلب الجانبي الضموري.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تحضير الفأر للجراحة

1. اختر الفأر المطلوب للزرع ( أي SOD1 (G93A) أو التحكم) وقم بوزن.
   ملاحظة: العمر والوزن الموصى به للفأر (ذكر أو أنثى) الذي يخضع لهذه الجراحة هو P56 - P120 و ≥ 24 جم على التوالي.
2. قم بتخدير الفأر تحت 3.5٪ من الأيزوفلوران بمعدل تدفق أكسجين 2 لتر / دقيقة. قم بإجراء قرصة إصبع القدم وقرصة الذيل للتأكد من أن الماوس مخدر بالكامل.
3. بمجرد التخدير ، أخرج الماوس من صندوق الإسقاط وحافظ على التخدير عبر مخروط الأنف عن طريق ضبط مستوى الأيزوفلوران على 1.5٪ ومعدل تدفق الأكسجين إلى 1 لتر / دقيقة. قم بإجراء قرصة إصبع القدم و / أو قرصة الذيل للتأكد من الحفاظ على التخدير.
4. ضع مرهم زيوت التشحيم لمنع العينين من الجفاف أثناء الجراحة.
5. احلق الفأر لكشف موقع جراحي بين الأذن والكتف ( الشكل 1C ).
6. قص أظافر القدم في نفس الجانب في موقع الجراحة لتقليل فرصة سحب الفأر للخيوط أو التسبب في الجروح عن طريق الخدش أثناء عملية الشفاء.
7. قم بمسح موقع الجراحة بالتناوب ، أولا بالمطهر ثم باستخدام الأيزوبروبانول. كرر 2 مرات أخرى.

2. زرع جهاز القياس عن بعد لتسجيل نشاط تخطيط كهربية العضل (EMG)

1. ضع تحت مجهر التشريح ، على جانبه فوق وسادة معقمة تغطي وسادة تدفئة ، وقم بتأمين مخروط الأنف في مكانه بشريط لاصق. لاحظ أنه من الأفضل زرع الجانب الأيمن لتقليل إشارة مخطط كهربية القلب (ECG) الناشئة من القلب.
   ملاحظة: مراقبة التنفس وضبط مستويات الأيزوفلوران ، إذا لزم الأمر ، للحفاظ على معدل تنفس منتظم ومستوى جراحة مناسب للتخدير.
2. اسحب الطرف الأمامي باتجاه القدم المماثلة على طول الجذع.
   ملاحظة: يزيح هذا الوضع لوح الكتف الذيلي، مما يوفر وصولا جراحيا إلى عضلات القشور وشبه المنحرف.
   1. خذ الملقط المنحني غير الحاد ، وأمسك المخلب الأمامي إلى موقع الجراحة ، وقم بلصق المخلب في مكانه ( الشكل 1C ). استخدم شريطا جراحيا لاصقا قويا للتأكد من أن المخلب آمن طوال مدة الإجراء.
3. ارتد زوجا جديدا من القفازات الجراحية. استخدم المشرط لعمل شق مائل ، بطول 2 سم تقريبا ، بين الكتف والأذن (الخط الأحمر في الشكل 1C ).
4. باستخدام ملقطين لاستئصال الصفيحة الفقرية # 2 ، واحدة في كل يد ، اسحب الوسادة الدهنية للخلف وافرد عضلات شبه المنحرف والعضلة لفضح اللفافة التي تغطي عضلات القصية الترقوية الخشائية والعضلات القاسلية ( الشكل 1D و E ).
5. استخدم العضلة القصية الترقوية الخشائية الباهتة والعصب الحجابي كمعالم لتحديد عضلات السكالين. لاحظ أن العصب الحجابي يمتد بالتوازي مع عضلات سكالين ، بينما يقع القصية الترقوية الخشائية السفلية. تمتد عضلات المقياس بشكل غير مباشر من فقرات عنق الرحم إلى الأضلاع الموجودة أسفل العضلة شبه المنحرفة. سيتم إدخال خيوط الجهد الحيوي في العضلة الأمامية ، والتي يمكن تحديدها على أنها العضلة التي تمتد بجوار العصب الحجابي ( الشكل 1F و G ).
   ملاحظة: تحذير. هذه المنطقة شديدة الأوعية الدموية ، ويجب توخي الحذر لتجنب قطع الشريان تحت الترقوة. تجنب إتلاف العصب الحجابي والضفيرة العضدية.
6. بمجرد تحديد عضلات القشور وشبه المنحرف ( الشكل 1G ) ، قم بعمل جيب تحت الجلد لجهاز الإرسال الموجود على ظهر ، بين لوح الكتف.
   1. استخدم مقص فصل الأنسجة. أدخل الأطراف الحادة أسفل الجلد مباشرة وافردها حتى يتكون جيب يفتح حوالي 1.25 ضعف عرض جهاز الإرسال ( الشكل 1H).
      ملاحظة: يجب إدخال جهاز الإرسال بأقل قدر من المقاومة، ولكن يجب ألا يكون الجيب كبيرا بحيث يمكن لجهاز الإرسال أن يتحرك من تلقاء نفسه. إذا كان الجيب صغيرا جدا ، فقد يحتك جهاز الإرسال بالجلد ، مما يتسبب في تهيج قد يدفع إلى خدش الجلد و / أو سحب الرصاص للخارج. إذا كان الجيب كبيرا جدا ، فقد تتشكل التورم المصلي ، أو يمكن أن ينتقل جهاز الإرسال إلى وضع غير موات.
7. اغسل بمحلول ملحي دافئ ومعقم وأدخل جهاز الإرسال مع الجانب المسطح على العضلات. ضع جهاز الإرسال بحيث يكون مسطحا وتخرج الأسلاك من الجيب، موازية لبعضها البعض بدلا من أن تكون ملتوية ( الشكل 1I). قم بلف أي طول زائد من الأسلاك أسفل الجهاز وضعه بشكل مسطح.
8. قم بتشغيل الخيوط من جهاز الإرسال إلى عضلات المقياس وشبه المنحرف بحيث تكون مجموعتا الخيوط ثنائية الجهد مسطحة ومتوازية مع بعضها البعض.
9. استخدم ملقط استئصال الصفيحة الفقرية لفصل المقياس الأمامي عن العضلات المحيطة وإدخال إبرة قياس 25 متعامدة مع ألياف العضلات من خلال العضلة القماشية.
   1. أدخل خيطا واحدا في طرف الإبرة ثم اسحب الإبرة من العضلات ، تاركا وراءها الرصاص الذي يتم إدخاله في العضلة حتى عزل السلك ( الشكل 1J و K ). سجل الخيوط الملونة التي يتم إدخالها في أي عضلة.
10. ضع قطرة صغيرة من مادة لاصقة cyanoacrylate على الطرف المكشوف من السلك ، بالقرب من العضلة حيث يتم إدخال الرصاص ، وحرك غطاء الرصاص بسرعة فوق السلك بحيث لا يتعرض أي سلك بين غطاء الرصاص والعضلة ( الشكل 2A و B ).
    ملاحظة: على الرغم من أنه من الممارسات المقبولة تأمين خيوط مخطط كهربية العضل باستخدام السيانوا أكريلات ، إلا أن الطريقة البديلة هي ربط عقدة خياطة حريرية حول غطاء الرصاص.
11. قم بقص السلك الزائد البعيد عن الغطاء وقم بتطبيق قطرة من مادة لاصقة cyanoacrylate على نهاية غطاء / سلك الرصاص. امنح الغراء وقتا للبلمرة قبل إطلاقه ( الشكل 2C و D ).
12. اتبع نفس الخطوات (الخطوات 3.10-3.12) لإدخال سلك القطبية المعاكس الموازي للأول في نفس العضلة ، على بعد 1-2 مم من الرصاص الأول.
13. كرر الخطوات 3.10 - 3.12 لإدخال خيوط في العضلة شبه المنحرفة ، والتي تقع أمام عضلة المقياس مباشرة ( الشكلان 1L و M ).
14. تأكد من تثبيت أسلاك الأسلاك في مكانها وأن هناك ما يكفي من الركود للحيوان لأداء حركات الجسم دون سحبها. تأكد من أن أي طول زائد من الرصاص لا يدفع على الجلد ، لأن ذلك قد يسبب تهيجا قد يدفع إلى خدش الرصاص أو سحبه للخارج. أعد وضع الخيوط ، إذا لزم الأمر ، لمنع أي إزعاج محتمل.
15. قم بإزالة الشريط اللاصق الذي يثبت الطرف الأمامي برفق. اسحب وسادة الدهون للخلف فوق العضلات واستخدمها لتغطية الخيوط المدرجة. أغلق الشق بمادة لاصقة سيانواكريليت عن طريق إغاظة اللوحات الجلدية معا مرة أخرى بحيث يصطف الشق. اضغط على جزء من سدائل الجلد مع الملقط المنحني وقم بتطبيق خط صغير من مادة لاصقة سيانواكريليت على طول هذا الخط.
16. حقن 0.1 مل من الكاربروفين تحت الجلد لتخفيف آلام ما بعد الجراحة بينما لا يزال تحت التخدير.
    ملاحظة: استمر في إعطاء 0.1 مل من الكاربروفين مرة واحدة يوميا لمدة 1 - 2 أيام بعد الجراحة، ثم حسب الحاجة بعد ذلك.
17. أخرج من مخروط الأنف وضعه في قفص نظيف في الحاضنة الدافئة مسبقا حتى يستيقظ ويتحرك حول القفص طواعية. بعد ذلك ، احتفظ بالحيوان في الحاضنة لمدة 15 دقيقة على الأقل ، وراقب تحركاته ويقظته.

3. رعاية ما بعد الجراحة

1. المنزل بشكل منفصل بعد الجراحة. زود الشفاء بجل الحمية وزجاجة ماء.
2. راقب في أول 30 دقيقة بعد الجراحة. افحص كل ساعة على الأقل لمدة 5 ساعات بعد الجراحة. في الأيام التي تلي الجراحة ، تحقق مرتين يوميا على الأقل.
3. راقب النخر والعدوى على طول الشق وداخل تجويف الجسم الذي يحتوي على الغرسة ( أي الحرارة والتورم والاحمرار) وتكوين التورم المصلي.
   ملاحظة: تحدث هذه العلامات خلال الأسبوع الأول بعد الجراحة. الشكل 1N يظهر سليما وشافى بعد شهر واحد من الجراحة. على الرغم من أنه يمكن إجراء تسجيلات مخطط كهربية العضل مباشرة بعد الزرع ، إلا أن تعطى أسبوعا واحدا على الأقل للشفاء قبل تسجيل تخطيط كهربية العضل وتخطيط التحجم ، حيث يمكن أن تكون إشارات تخطيط القلب عالية مباشرة بعد الزرع.

4. الحصول على إشارات تخطيط كهربية العضل وتخطيط التمم المتزامن

1. تشغيل جميع معدات الاستحواذ ، بما في ذلك تدفق التحيز.
   ملاحظة: عادة ما يتم ضبط معدل التدفق للفئران على 1.0 لتر / دقيقة.
2. معايرة غرفة (غرف) التضخم باستخدام مقياس التدفق.
   ملاحظة: افحص بشكل دوري غرف التحجم للتأكد من عدم تشقق الأختام أو كسرها للحفاظ على حالتها الجيدة ، قم بتغطية الأختام المطاطية بمواد تشحيم مثل الشحوم المفرغة مرة واحدة في الأسبوع.
3. معايرة مرسل الإدخال على النحو المحدد من قبل الشركة المصنعة.
4. ضع الفأر في غرفة تخطيط التحجم لمدة ساعة واحدة على الأقل للتأقلم معه قبل تسجيل تخطيط كهربية العضل وتخطيط التضخم. باستخدام غرف متعددة ، من الممكن التسجيل من ماوس واحد بينما يتأقلم الماوس التالي في غرفة ثانية. لا تقم بتشغيل جهاز الإرسال أثناء فترة التأقلم للحفاظ على طاقة البطارية ( الشكل 1O ).
5. قبل التسجيل (ولكن بعد المعايرة) ، قم بتشغيل جهاز الإرسال عن طريق وضع مغناطيس قوي في نطاق 1 بوصة من المزروع ؛ سيشير ضوء أحمر في مقدمة جهاز الاستقبال إلى وقت تشغيل جهاز الإرسال.
6. ابدأ الاستحواذ باستخدام القائمة المنسدلة المسماة "اكتساب" واختر "بدء الاستحواذ". على الرغم من أن مدة التسجيل قد تختلف حسب التجربة ، إلا أن تصوير التحجم النموذجي وتسجيل مخطط كهربية العضل يستمر من 1 إلى 3 ساعات.
   ملاحظة: جهاز الإرسال لديه معدل أخذ عينات جوهري يبلغ 240 هرتز. يتم تعيين معدل أسرع يبلغ 500 هرتز في البرنامج للاستيفاء بين النقاط ولتوفير شكل موجة أكثر سلاسة. يحدد مرشح التمرير المنخفض (الذي يعمل كمرشح مضاد للاسم المستعار) ومرشح التمرير العالي في الغرسة عرض النطاق الترددي من 1 إلى 50 هرتز لجهاز القياس عن بعد هذا. لا يساهم تداخل التيار المكيف 60 هرتز في زيادة الضوضاء في إشارة مخطط كهربية العضل لأن الغرسات تعمل بالبطارية ، ويحمي الغرسة ويؤدي من المجالات الكهربائية. تتم مزامنة التحجم وتخطيط كهربية العضل والفيديو تلقائيا في الوقت الفعلي عبر برنامج الاستحواذ.
7. عند الانتهاء من عملية الاستحواذ ، قم بإيقاف تشغيل جهاز الإرسال بمغناطيس وإزالة من الغرفة.

النتائج

الشكل 1. زرع جهاز القياس عن بعد لقياس مخطط كهربية العضلة التنفسية. ( A) أجهزة إرسال القياس عن بعد مع زوجين من الجهد الحيوي تؤدي إلى قياس مخطط كهربية العضل. يمكن قص الخيوط إلى الطول المطلوب (أسفل) ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 Gur/J	Jackson Laboratory	4435
غرفة تحجم	Buxco Respiratory Products/Data Sciences International	601-1425-001
telemetry Receivers (Model RPC-1)	Data Sciences International	272-6001-001
مضخة تدفق التحيز (الموديل BFL0500)	Data Sciences International	601-2201-001
ACQ-7000 USB	Data Sciences International	PNM-P3P-7002XS
Dataquest A.R.T. Data Exchange Matrix	علوم البيانات الدولية	271-0117-001
New Ponemah Analysis System	Data Sciences International	PNM-POST-CFG
Ponemah Physiology Platform Acqusition software v5.20	Data العلوم الدولية	PNM-P3P-520
Ponemah Unrestricted Whole Breath Plethysmography Analysis package v5.20	Data Sciences International	PNM-URP100W
Configure Ponemah Software	علوم البيانات الدولية	PNM-P3P-CFG
Analysis Module (URP)	Data Sciences International	PNM-URP100W
Universal Amplifier	Data Sciences International
Sync Board	Data Sciences International	271-0401-001
Sync Cable	Data Sciences International	274-0030-001
Transducer-Pressure Buxco	Data Sciences International	600-1114-001
Flow Meter	Data Sciences International	600-1260-001
المغناطيس والراديو المضمنان في مجموعة المبتدئين F20-EET	Data Sciences International	276-0400-001
Axis P1363 Video	Data Sciences International	275-0201-001
Terg-A-Zyme	Fisher Scientific	50-821-785	Enzyme Detergent
Actril	Minntech Corporation	78337-000	Chemical Sterilant
Stereo Dissecting Microscope (Model MEB126)	Leica
-servo-controlled hummidifier / Infant Incubator	OHMEDA Ohio Care Plus	6600-0506-803
TL11M2-F20-EET Transmitters	Data Sciences International
Dumont #2 ملقط استئصال الصفيحة الصفيحية - نصائح قياسية / مستقيمة/12 سم (x2)	Fine Scientific Instruments	11223-20	For handling الأسلاك
Dumont # 2 ملقط استئصال الصفيحة الفقرية - أطراف قياسية / مستقيمة / 12 سم (x2)	الأدوات العلمية الدقيقة	for surgery
Narrow Pattern Fallps- Serrated / Curved/12cm	Fine Scientific Instruments	17003-12
Spring Scissors - Tough Cut / Straight / Sharp/12.5CM/6mm Cutting	الأدوات العلمية الدقيقة
Tissue Separating Scissors - Straight/Blunt-Blunt/11.5cm	Fine Scientific	14072-10
Fine Scissors - Tough Cut/Curved/Sharp-Sharp/9 cm	Fine Scientific Instruments	14058-11	for cut الأسلاك وقص المسامير
Scalpel Handle #3	World Precision Instruments	500236
Scalpel Blade	Fine Scientific Instruments	10010-00	for preparation the lead
Polysorb Braided Absorbable sustur	Coviden	D4G1532X	for coiling transmitters
Gluture	Zoetis Inc.	6606-65-1	Cyanoacrylate adhesive
3 mL Synring Slip Slip Tip - Soft	Vitality Medical	118030055
25G Needle (X2)	Becton Dickinson and Co.
Cotton Plicated Applicators	Henry Schein Animal Health	100-9175
Andis Easy Cut Hair Clipper Set	Andis	049-06-0271	ماكينة حلاقة كهربائية تباع في Target
29404
Isopropyl Alcohol 70٪	Priority Care 1	MS070PC
Dermachlor 2٪ Medical Scrub ( كلوروهيكسيدين 2٪)	55482
Artificial Tears	Henry Schein Animal Health	48272	Lubricant Opthalmic Ointment
Vacuum Grease	Dow Corning Corporation	1597418
Water Blanket	JorVet	JOR784BN