تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
- Animal and Tools
- استخدم ذكور Sprague-Dawley البالغة من العمر 8 أسابيع تزن الوزن 250 ± 10 جم.
- قم بإيواء الفئران لمدة 7 أيام على الأقل قبل الجراحة في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة مع درجة حرارة محيطة تبلغ 25 درجة مئوية ورطوبة نسبية تبلغ 65٪ ودورة فاتحة وظلامية لمدة 12/12 ساعة.
- توفير الطعام والماء بلا حدود.
- جهز الأدوات (الشكل 1A-E).
2. حقن الدم في pons
- وزن الفئران مرة أخرى قبل 3 أيام من الجراحة لاختيار الفئران ذات وزن الجسم المناسب للتجارب.
- خلال الأيام الثلاثة التي تسبق النمذجة، قم بتدريب الفئران على المشي على شعاع التوازن 3 مرات يوميا لضمان قدرة الفئران العادية على اجتياز شعاع التوازن دون توقف.
- سخن وسادة التسخين مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل التخدير.
- قم بإرفاق مثقاب دقيق بالحامل الموجود على الإطار التجسيمي.
- حقن الفئران مع 50 ملغم/كغ الكيتامين و 5 ملغ/كغ زيلازين داخل الصفاق. انتظر حتى لا تكون هناك استجابة لقرص إصبع القدم.
- انقل الجرذ إلى الإطار التجسيمي في وضع الانبطاح. ضع قضبان الأذن فوق قناة الأذن لتأمين الرأس. ثبت الجمجمة في وضع أفقي لتجنب انحراف الحقن (الشكل 1F).
- حافظ على التخدير بواسطة isoflurane (97.5٪ أكسجين و 2.5٪ إيزوفلوران) من خلال مخروط أنف تجسيمي مع منفذ مدخل ومخرج.
- استخدم مرهم العين للحفاظ على رطوبة القرنية.
- احلق الشعر فوق الجمجمة باستخدام ماكينة حلاقة صغيرة.
- ارسم خط منتصف 3 سم بقلم تحديد في الجمجمة من خط الكانثوس الجانبي الثنائي إلى 0.5 سم خلف اليافوخ الخلفي ، كما هو موضح في الشكل 1F.
- ضع مقشر Entoiodine الجراحي بطريقة دائرية، بدءا من منتصف خط الوسط المحدد وتدويره للخارج.
- ضع الستارة الجراحية.
- قم بعمل شق بمشرط على طول الخط الأوسط المحدد.
- استخدم قطعة قطن لإزالة أي دم محتمل.
- ضع قطعة من الملقط على كل جانب من رفرف فروة الرأس لكشف الجمجمة (الشكل 1G).
- اغمس قطعة قطن في محلول ملحي بنسبة 0.9٪ وقم بإزالة الأنسجة الضامة برفق من عظم الجمجمة لتجنب الأنسجة الضامة التي تعلق في الحفر الدقيق.
- ضع علامة على النقطة المركزية للبريجما كنقطة أصل عبر قلم تحديد.
- قم بإجراء بضع القحف (قطره 1 مم) باستخدام مثقاب دقيق عند AP-9.0 مم ، Lat 0 مم (الشكل 2 ب والجدول 1). تابع بحذر لأن هذه النقطة قريبة جدا من الجيوب الأنفية الوريدية (الشكل 1G).
- قم بإزالة microdrill من الإطار التجسيمي.
- ضع حقنة هاميلتون سعة 100 ميكرولتر في الحامل التجسيمي (الشكل 1K). قم بتشغيل مفتاح مضخة الحقن ، وانقر فوق زر الاستنشاق السريع ، وشفط محلول الهيبارين (12500 وحدة مخفف في 100 مل من المحلول الملحي) إلى 100 ميكرولتر ثم صفيه تماما لمنع تخثر الدم بسرعة كبيرة.
- ضع الكلورهيكسيدين ومقشر جراحي كحولي 75٪ على الذيل بالكامل من الجذر إلى الحافة 3 مرات على الأقل لتطهير الجلد، وتنعيم القرنية، وتوسيع الوريد الذيل لزيادة معدل نجاح الحقن.
- قم بتوصيل الوخز بالإبر لفروة الرأس بحقنة سعة 1 مل.
- أدخل الوخز بالإبر في فروة الرأس في وريد الذيل الجانبي على بعد 3 سم من طرف الذيل وخذ 150 ميكرولتر من الدم (الشكل 1H).
- قم بإزالة الوخز بالإبر في فروة الرأس من حقنة 1 مل.
- نقل الدم إلى أنبوب (الشكل 1I).
NOTE: نقل بسرعة لمنع تخثر الدم. - تغيير القفازات الجراحية.
- اختر وضع الانسحاب، واضبط مستوى الصوت على 100 ميكرولتر، واضبط السرعة على 200 ميكرولتر/دقيقة، وانقر فوق الزر RUN، واستنشق 100 ميكرولتر من الدم في حقنة هاميلتون (الشكل 1J).
- اختر وضع Infuse واضبط السرعة على 1 ميكرولتر / دقيقة.
- تقدم المحقنة حتى يصل الطرف إلى 9.2 مم تحت سطح الدماغ (الشكل 2C والشكل 1L).
- انقر فوق الزر "تشغيل" لحقن أول 10 ميكرولتر من الدم بسرعة 1 ميكرولتر/دقيقة (الجدول 1).
- أوقف الحقن واترك المحقنة في موضعها لمدة 20 دقيقة لمنع الدم من التدفق إلى الفضاء تحت العنكبوتية.
- اسحب المحقنة حتى يصل الطرف إلى 9.0 مم تحت سطح الدماغ.
- أعد تشغيل الحقن بنفس سرعة 1 ميكرولتر/دقيقة حتى يتم حقن الدم المتبقي بالكامل.
- اترك المحقنة في موضعها لمدة 10 دقائق لتجنب ارتجاع الدم.
- قم بإزالة المحقنة من الدماغ ببطء.
- استخدم الأسمنت العظمي لتغطية ثقب حج القحف.
- عندما يجف الأسمنت، قم بخياطة الجرح بخيط خيوط 4-0 من مادة البولي أميد. بعد خياطة 3 أو 4 غرز ، اربط عقدة جراحية قياسية 2-1-1.
- للوقاية من العدوى، حقن الجرذ بالبنسلين (0.25 مل، 80 وحدة دولية مخففة في محلول ملحي 4 مل) داخل الصفاق
- حقن الفئران تحت الجلد بطرطرات بوتورفانول (2.5 ملغم/كجم) وكرر الحقن كل ساعتين لتخفيف آلام ما بعد الجراحة حتى 24 ساعة بعد الجراحة.
- راقب الجرذ كل 15 دقيقة حتى يتعافى تماما من التخدير. أعده إلى القفص الأصلي ، مع وسادة تدفئة أسفل القفص. وفر للفئران حرية الوصول إلى الطعام والماء حتى التضحية.
الجدول 1: حقن الدم الذاتي.
<فئة الشكل = نمط الجدول: "تعويم: اليسار" ؛ "><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> < col style = 'العرض: 25٪ ؛ '> < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحدود: 0.625pt #1a202c الصلبة ؛ الحشو: 4pt 2pt ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> نمط < td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحدود: 0.625pt #1a202c صلبة ؛ الحشوة: 4pt 2pt ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ 'نمط >
معتدل
Medium
Massive
إجمالي حجم
30 μL
< td style='background-color:#ffffff;border:0.625pt صلبة #1a202c;boardding:4pt 2pt;vertical-align:top;'>
60 μL
100 μL
< td style='لون الخلفية:#ffffff;الحدود:0.625pt صلبة #1a202c;الحشو:4pt 2pt;vertical-align:top;'>
First injection
<td style='background-color:#ffffff;border:0.625pt solid #1a202c;padding:4pt 2pt;vertical-align:top;'> < نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحدود: 0.625 نقطة #1a202c صلبة ؛ الحشو: 4 نقطة 2 نقطة ؛ محاذاة رأسية: أعلى ؛> < td style='background-color:#ffffff;border:0.625pt صلب #1a202c;boardding:4pt 2pt;vertical-align:top;'>
Stereotactics
AP -9.0 mm; لات 0 ؛ Vert -9.2 مم
< td style = 'border: 0.625pt solid #1a202c ؛ padding: 4pt 2pt ؛ vertical-align: top ؛ '>
Volume
10 μL
10 μL
10 μL
السرعة
1 μL/min
1 μL/min
1 μL/min
Interval time
20 min
20 min
20 min
Second injection
vertical-align:top;'
Stereotactics coordinates
AP -9.0 mm; لات 0 ؛ Vert -9.2 مم
< td style = 'border: 0.625pt صلب #1a202c ؛ حشوة: 4pt 2pt ؛ vertical-align: top ؛ '>
AP -9.0 mm; لات 0 ؛ Vert -9.0 مم
< نمط td = 'الحدود: 0.625pt #1a202c صلبة ؛ الحشوة: 4 نقطة 2pt ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>
الحجم
< td style='الحدود: 0.625pt #1a202c صلبة ؛ الحشوة: 4pt 2pt ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>
50 μL
90 μL
السرعة
1 μL/min
1 μL/min
1 μL/min
'before withdraw of the
needle
10 min
10 min
10 min
AP: الموضع الأمامي الخلفي
<نمط TD = 'الحدود: 0.625pt #1a202c صلبة ؛ الحشو: 4 نقطة 2 نقطة ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> < نمط TD = 'الحدود: 0.625pt #1a202c صلب ؛ الحشوة: 4 نقطة 2 نقطة ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> نمط < TD = 'الحدود: 0.625pt #1a202c صلبة ؛ الحشو: 4 نقطة 2 نقطة ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> نمط < TD = 'الحدود: 0.625pt #1a202c صلب ؛ الحشوة: 4 نقطة 2 نقطة ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ نمط >< p = 'محاذاة النص: تبرير>
Lat: الجانبي< td style='border:0.625pt صلبة #1a202c;boardding:4pt 2pt;vertical-align:top;'>
Vert: نمط < TD
الرأسي = 'الحدود: 0.625 نقطة #1a202c صلبة ؛ الحشو: 4 نقطة 2 نقطة ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> < نمط TD = 'الحدود: 0.625 نقطة #1a202c صلبة ؛ الحشو: 4 نقطة 2 نقطة ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> نمط < TD = 'الحدود: 0.625 نقطة #1a202c صلبة ؛ الحشو: 4 نقطة 2 نقطة ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛'>