تأثير الحرمان من الأكسجين والجلوكوز وإعادة الأكسجة على التفاعلات بين الخلية والخلية

الملخص

المصدر: Alluri, H., et.al. الحرمان من الأكسجين والجلوكوز وإعادة الأكسجين كنموذج في المختبر لإصابة نقص التروية وإعادة التروية لدراسة الخلل الوظيفي في الحاجز الدموي الدماغي. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح الفيديو تأثير الحرمان من الأكسجين والجلوكوز وإعادة الأكسجين اللاحقة على الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في دماغ الفئران (RBMECs) من خلال محاكاة حالات نقص الأكسجين والحرمان من المغذيات. تؤدي هذه الظروف إلى استنفاد ATP ، وزيادة الكالسيوم داخل الخلايا ، وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، والتي تتحلل بروتينات تقاطع الخلايا وتحفز تكوين ألياف الإجهاد ، وبالتالي تضعف تفاعلات الخلية الخلوية.

البروتوكول

1. بذر الخلايا البطانية

1. احصل على الثقافات الأولية ل RBMECs من فئران Sprague Dawley البالغة (أو احصل عليها تجاريا).

2. قم بزراعة RBMECs في أطباق بتري المغطاة بحجم 100 سم (50 ميكروغرام / مل) باستخدام وسط نمو الخلايا البطانية في دماغ الفئران. قم بتغيير الوسيط كل يومين حتى يتم الوصول إلى التقاء.

3. عند الوصول إلى التقاء 80-90٪ ، اغسل الخلايا برفق في محلول ملحي مخزن بالفوسفات سعة 5 مل (PBS) عن طريق الدوران. ثم يتم فصل الخلايا عن طريق تعريضها إلى 1 مل من محلول حمض التربسين الدافئ بنسبة 0.25٪ - إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، متوازن إلى 37 درجة مئوية.

4. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق حتى يتم فصل الخلايا وتشتتها. } ملاحظة: اضغط على طبق المزرعة لفصل الخلايا. اعرض الخلايا تحت المجهر لتأكيد الانفصال الكامل للخلايا عن سطح الطبق.

5. أضف 5 مل من الوسائط الكاملة إلى طبق بتري لتحييد التربسين. قم بإخراج الوسط الذي يحتوي على خلايا منفصلة وجمعه في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.

6. جهاز الطرد المركزي الوسائط التي تحتوي على خلايا بطانية عند 220 × جم لمدة 5 دقائق.

7. استنشاق المادة الطافية والحفاظ على الخلايا المحتوية على الحبيبات. الحبيبات في 3-5 مل وسط نمو الخلايا البطانية لدماغ الفئران الطازجة عن طريق خلطها برفق لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة. سيتم بعد ذلك حساب الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس كثافة الدم.

8. انقل تعليق الخلية إلى نظام انزلاق غرفة معقمة من 8 آبار مطلي مسبقا ب 0.7 سم مربع / بئر بكثافة بذر تتراوح بين 10,000-15,000 خلية لكل بئر. قم بزراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى يتحقق التقاء ملاحظة: لإجراء البقع الغربية أو التجارب الأخرى ، يمكن زراعة الخلايا في أطباق زراعة الخلايا مقاس 10 سم أو أطباق خاصة كما هو مطلوب في التجربة.

2. الحرمان من الأكسجين والجلوكوز - إعادة الأكسجين في المختبر

1. استخدم نظام زراعة خلايا نقص الأكسجة لدراسة تأثيرات OGD-R على RBMECs (انظر الشكل 1 ). قم بإعداد ومعايرة نظام زراعة خلايا نقص الأكسجة قبل بدء التجربة ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

2. قم بإزالة شرائح الغرفة المتقاربة (الخطوة 1.8) من الحاضنة 37 درجة مئوية. استبدل الوسط الكامل في شريحة الغرفة بوسط النسر المعدل (DMEM) منزوع الأكسجين ، بدون جلوكوز ، ووضعه في غرفة نقص الأكسجة مع 95٪ نيتروجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية ، لتمثيل حالة OGD.

3. انقل الخلايا مرة أخرى إلى الحاضنة التي تحتوي على 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية وتزويدها بخلية بطانة دماغ الفئران الطازجة وسيطا كاملا واحتضانها لمدة ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية.

ملاحظة: تمثل هذه الخطوة حالة إعادة أكسجين.

النتائج

المواد

< فئة الشكل = نمط "الجدول" = 'العرض: 801 نقطة ؛ '>< فئة الجدول = 'ck-table-resize'>< col style = 'width: 27.72٪ ؛ '>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td style = 'height: 14.5pt ؛ '> Proox model 110BiospherixModel 110 DMEM ، بدون جلوكوزGibco ، Life technologies11966-025 Rhodamine PhalloidinLife technologiesR415 ZO-1 Rabbit Polyclonal AntibodyLife Technologies617300 Nunc Lab Tek II-CC 8 معقمة جيدا,
شرائح زجاجية177402 علمية حرارية الثانوية المضادة للأرانب الموسومة FITC
الجسم المضادسانتا كروزSC-2090 DPBS 1XThermo scientificSH 30028.03يمكن استخدام أي PBS آخر متاح