الترسيب المناعي للكروماتين الأصلي لخلايا الغلاف العصبي

الملخص

المصدر: Mendez، F. M. et al.، ترسيب مناعي للكروماتين الأصلي باستخدام المجالات العصبية لأورام دماغ الفئران. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو عزل مجمعات البروتين والحمض النووي عن خلايا الغلاف العصبي المشتقة من ورم في دماغ الفأر باستخدام ترسيب المناعة الأصلي للكروماتين. يوضح بالتفصيل خطوات تحضير الكروماتين ، والترسيب المناعي ، والغسيل ، وهضم البروتين لإطلاق الحمض النووي لتحليله في اتجاه مجرى النهر.

البروتوكول

1. Native chromatin immunoprecipitation (ChIP)

1. Chromatin preparation
   1. بعد عمل مخزون من خلايا الغلاف العصبي المشتقة (NS) ، قم بزراعة NS في قارورة T-75 في 15 مل من وسط NSC عند 37 درجة مئوية في حاضنة لزراعة الأنسجة بجو 95٪ هواء و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ حتى تصبح NS ملتقية. ستنتج لوحة T-75 المتقاربة 3-5 × 10⁶ خلايا.
   2. عندما تصبح الخلايا ملتقية، جهاز الطرد المركزي NS عند 300 × جم لمدة 5 دقائق، وصب المادة الطافية وإضافة 1 مل من وسط تفكك الخلية. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أضف 5 مل من الوسط واحسب الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
      NOTE: هناك حاجة إلى 1 × 10⁶ خلايا لكل تفاعل ترسيب مناعي (IP). لاحظ أنه يجب أيضا تضمين مصل ما قبل المناعة أو التحكم في IgG.
   3. الطرد المركزي NS في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، صب المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات NS مع 1 مل من محلول الملح المتوازن ونقل التعليق إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة منخفضة البروتين 1.5 مل.
   4. جهاز طرد مركزي NS عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، صب المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 95 ميكرولتر من محلول الهضم (50 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0 ، 1 ملي CaCl₂ ، 0.2٪ بولي إيثيلين جلايكول أوكتيل فينيل الأثير) لكل 1 × 10⁶ خلايا مكملة بكوكتيل مثبط للبروتياز بتركيز عال (1: 100). قم بسحب الخلايا على الفور لأعلى ولأسفل لمنع التكتل وتجنب تكوين أي فقاعات.
   5. قم بتعليق نوكلياز المكورات الدقيقة (MNase) في 50٪ من الجلسرين لصنع محلول 1 ملغم/مل (1.15 وحدة/ميكرولتر، مخزن عند -20 درجة مئوية) والذي سيشار إليه باسم مخزون "1x". اصنع مخزونا "0.1x" عن طريق إجراء تخفيف ثان بنسبة 1: 9 مع 50٪ جلسرين (على سبيل المثال ، 900 ميكرولتر من MNase "1x" و 100 ميكرولتر من 50٪ جلسرين) وقم بتخزينه عند -20 درجة مئوية.
   6. امزج 5 ميكرولتر من "0.1x" MNase و 145 ميكرولتر من المخزن المؤقت للهضم. احتفظ بالإنزيم على الجليد طوال الوقت. أضف 5 ميكرولتر من MNase المخفف في المخزن المؤقت للهضم لكل 1 × 10⁶ خلايا. انقر فوق الأنبوب لخلط الأنبوب ووضعه في كتلة 37 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة بالضبط. قم بمعالجة العينات واحدة تلو الأخرى لضمان وقت حضانة دقيق يبلغ 12 دقيقة.
   7. أضف 10 ميكرولتر من 10x MNase Stop Buffer (110 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0 ، 55 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)) لكل 1 × 10⁶ خلايا. يجب حفظ العينات على الجليد من هذه النقطة فصاعدا.
   8. أضف 110 ميكرولتر "2x المخزن المؤقت لفحص الترسيب المناعي المشع (RIPA)" (280 ملي كلوريد الصوديوم ، 1.8٪ بولي إيثيلين جلايكول أوكتيل فينيل الأثير ، 0.2٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، 0.2٪ Na-deoxycholate ، 5 ملي مولار إيثيلين جلايكول مكرر (β-أمينوإيثيل الأثير) -N ، N ، N '، N'، N'-حمض رباعي الأسيتيك (EGTA) ؛ مخزن عند 4 درجات مئوية) مكمل بكوكتيل مثبط البروتياز بتركيز عال (1: 100) لكل 1 × 10⁶ خلايا. انقر فوق الأنبوب للخلط.
   9. الطرد المركزي الأنابيب لمدة 15 دقيقة في جهاز ميكرو فيوج عند 4 درجات مئوية و 1700 × جم. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق عادي جديد سعة 1.5 مل (لم تعد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة منخفضة البروتين ضرورية) وقم بتخزينها على الثلج. تخلص من الحبيبات.
      
2. Immunoprecipitation (IP)
   1. Mix Protein A والبروتين G المغناطيسي بنسبة 1:1. لكل IP ، قم بإعداد 25 ميكرولتر من الخرز.
   2. اغسل الخرزات بإضافة 1 مل من RIPA buffer (10 ملي مولار Tris pH 8.0 ، 1 ملي مولار EDTA ، 140 ملي كلوريد الصوديوم ، 1٪ بولي إيثيلين جلايكول أوكتيل فينيل الأثير ، 0.1٪ SDS ، 0.1٪ Na-deoxycholate ؛ مخزنة عند 4 درجات مئوية) مكملة بمثبطات الإنزيم البروتيني بتركيز منخفض (1: 1000).
   3. استخدم مغناطيسا للسماح للخرز بالانفصال عن محلول الغسيل وصب محلول الغسيل (حوالي 1 دقيقة). قم بتنفيذ خطوة الغسيل مرتين.
   4. أعد تعليق الخرزات إلى الحجم الأصلي باستخدام المخزن المؤقت RIPA المكمل بمثبطات الإنزيم البروتيني (1: 1000).
   5. إذا لزم الأمر، قم بتخفيف الكروماتين باستخدام المخزن المؤقت RIPA المكمل بمثبطات الإنزيم البروتيني (1:1000) بحيث يكون لكل IP حجم 100-200 ميكرولتر. احتفظ بنسبة 10٪ من الحجم المستخدم لكل IP من الكروماتين للإدخال.
      NOTE: على سبيل المثال، إذا تم استخدام 200 ميكرولتر لكل IP، فيجب حجز 20 ميكرولتر من الكروماتين المخفف للإدخال. بالنسبة لما مجموعه أربعة عناوين IP ، يجب تخفيف الحجم الكلي للكروماتين إلى 820 ميكرولتر.
   6. قم بإعداد الإدخال. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE (10 ملي مولار Tris-HCl الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 1 ملي مولار EDTA) مكملا بالبروتيناز K (0.5 مجم / مل) إلى المدخلات واحتضان المدخلات عند 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
   7. قم بتنقية المدخلات باستخدام مجموعة تنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باتباع تعليمات الشركة المصنعة وقم بإزالتها في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف المتوفرة في المجموعة.
   8. قياس تركيز الإدخال باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير وسجل النتائج في دفتر ملاحظات. فارغة مع المخزن المؤقت للشطف من المجموعة.
      NOTE: في المجالات العصبية للفأر، استخدمنا ما يقرب من 6 ميكروغرام من الحمض النووي لكل IP.
   9. تشغيل الإدخال على هلام 1٪ أو قم بتحميل 1 ميكرولتر على محلل حيوي للحمض النووي باستخدام الإعدادات القياسية. قم بتخزين الباقي لاستخدامه كمدخلات في تطبيقات المصب.
   10. أضف 10 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المغسول A & G لكل IP واحتضن IP لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
       NOTE: على سبيل المثال، أضف 30 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي البروتين A & G لثلاثة عناوين IP.
   11. ضع العينات على مغناطيس واترك الخرزات تنفصل. قسم الكروماتين عن طريق نقل الكمية المحددة مسبقا إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
   12. أضف الجسم المضاد ولف الأغطية بغشاء بارافين بلاستيكي لتجنب التبخر. احتضان العينات طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الدوران عند 20 دورة في الدقيقة.
       NOTE: يجب تحديد التركيز تجريبيا باتباع توصيات الشركة المصنعة.
   13. في اليوم التالي، قم بتدوير الأنابيب باستخدام جهاز طرد مركزي صغير في درجة حرارة الغرفة، 2000 × جم، لمدة 10 ثوان. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من الخرز إلى كل IP واحتضان IP لمدة 3 ساعات عند 4 درجات مئوية مع الدوران عند 20 دورة في الدقيقة.
       
3. IP Washes and Protein Digest
   1. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA المكمل بمثبطات الإنزيم البروتيني بتركيز منخفض (1: 1000) لكل IP واحتضان IP عند 4 درجات مئوية مع دوران عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. ضع العينة على حامل مغناطيسي واترك الخرزات المغناطيسية تنفصل. استخدم ماصة لإزالة المادة الطافية. كرر هذه الخطوة خمس مرات.
   2. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكلوريد الليثيوم (LiCl) (250 ملي مولار LiCl، 10 ملي مولار تريس الرقم الهيدروجيني 8.0، 1 ملي مولار EDTA، 0.5٪ NP-40، 0.5٪ Na-deoxycholate؛ يخزن في 4 درجات مئوية) مكملة بمثبطات الإنزيم البروتيني بتركيز منخفض (1: 1000) لكل IP واحتضان IP عند 4 درجات مئوية مع دوران عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. ضع العينة على حامل مغناطيسي واترك الخرزات المغناطيسية تنفصل. استخدم ماصة لإزالة المادة الطافية.
   3. أضف 150 ميكرولتر من Tris-EDTA البارد (TE) (بدون مثبطات للبروتينات) واحتضان العينة عند 4 درجات مئوية مع الدوران عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. ضع العينة على حامل مغناطيسي واترك الخرزات المغناطيسية تنفصل. استخدم ماصة لإزالة المادة الطافية.
   4. بعد خطوة الغسيل النهائية، أعد تعليق العينة في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE المكمل بالبروتيناز K (0.5 ملغم/مل) واحتضان العينة عند 55 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = 'collapse border: collapse ؛ font-family: Calibri ؛ حجم الخط: 11pt ؛ تخطيط الجدول: ثابت ؛ 'cellpacing = '0' cellpadding = '0' dir = 'ltr' border = '1' data-sheets root = '1' data-sheets baot = '1'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2946-90004bioanalyzerAccuSpin Micro 17R ، المبردة < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden; padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom;'>Fisher Scientific13-100-676< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> C57BL / 6TaconicB6-fC57BL / 6 mouse< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> calcium كلوريد Aldrich22350-6buffer reagentD-Luciferin, ملح البوتاسيومGoldbioLuckK-1gDiaMag1.5 magnetic rackDiagenodeB04000003for magnetic bead washesDiaMag Rotator EUDiagenodeB05000001rotatorDMEM / F-12Gibco11330-057NSC componentDynabeads Protein AThermo Fisher Scientific10001D< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;boardding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>protein A المغناطيسية الخرزDynabeads Protein GThermo Fisher Scientificprotein G المغناطيسية الخرزEGFAF-100-15 قم بإعداد مخزون 20 ميكروغرام/مل في 0.1٪ BSA وحصة.Ethylenediaminetetraacetic acid acid (EDTA)Sigmabuffer reagent ethylene glycol-bis (β-aminoethyl ether)-N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA)< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>SigmaE-4378buffer reagent< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Fetal Bovine SerumGibco10437028for frozen cells< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>FGFPeproTech100-18b< td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> قم بإعداد 20 ميكروغرام / مل من المخزون في 0.1٪ BSA و aliquot.CouppsFine Science Tools11008-13for تشريح الورمالجلسرين ، ميغابايت الصف < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom;'>EMD- Millipore356352 HBSSGibco14175-103 متوازن salt solution< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>FlurisoVETone501017< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> استنشاق مخدرIvis SpectrumPerkin-Elmer< نمط TD = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛' >124262 < نمط TD = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> في الجسم الحي نظام التصوير البصري < نمط tr = 'الارتفاع: 19 بكسل ؛' >< نمط TD = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليسرى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الفائض: مخفي. الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ >HyqtaseHyClonSV3003001cell detachment mediaLithium ChlorideSigmaL8895buffer reagentالأنابيب الدقيقة منخفضة الربط < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom;'>Corning Costar < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '>CLS3207 < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '>low أنبوب الطرد المركزي الدقيق ملزمة البروتين < نمط TR = 'الارتفاع: 19 بكسل ؛ '>< نمط TD = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليسرى : 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>أنبوب الطرد المركزي الدقيق < نمط TD = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ > فيشر< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>21-402-903normal microcentrifuge tubeMicrococcal NucleaseThermo Fisher Scientific, Affymetrix70196YN2Gibco17502-048NSC componentNormocinInvivogenNOL-36-063 عامل مضاد للميكروبات، استخدم عند 0.1 ملغم/مل.NP-40 (Igepal CA-630)Sigma18896-50MLbuffer reagentKimble Kontes Pellet Pestle < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> Fisher Scientific < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '>K749515-0000< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> protease Inhibitor CocktailSigma-AldrichP8340aliquot and storage at -20 °C.protinase KSigma-Aldrich< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>P2308make 10 mg/ml مخزون في الماء؛ aliquot وتخزينها عند -20 °C.QIAquick PCR Purification KitQiagen28104the DNA purification kit< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>ScalpelFine Science Tools10007-16for تشريح الورمكلوريد الصوديوم < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>VWR < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ حشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> 0241-5KG كاشف العازلةSodium DeoxycholateSigma-AldrichD670-25Gbuffer reagentكبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ blockding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom;'>SigmaL-4390buffer reagentTris BaseThermo Fisher ScientificBp152-1buffer reagent< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Triton X-100Thermo Fisher Scientific< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>BP 151-500polyethylene glycol octylphenyl etherجهاز الطرد المركزي القياسي الصغير< نمط td = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> فيشربراند < td النمط = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> 12-006-901 < نمط TD = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>جهاز الطرد المركزي الصغير القياسي < نمط TD = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليسرى: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> SZX16 المجهر < نمط TD = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>أوليمبوسSZX16fluorescent dissecting microscopeNanodrop OneThermo-Fisher ScientificND-ONEC-W