الترسيب المناعي للكروماتين الأصلي لخلايا الغلاف العصبي

الملخص

المصدر: Mendez، F. M. et al.، ترسيب مناعي للكروماتين الأصلي باستخدام المجالات العصبية لأورام دماغ الفئران. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو عزل مجمعات البروتين والحمض النووي عن خلايا الغلاف العصبي المشتقة من ورم في دماغ الفأر باستخدام ترسيب المناعة الأصلي للكروماتين. يوضح بالتفصيل خطوات تحضير الكروماتين ، والترسيب المناعي ، والغسيل ، وهضم البروتين لإطلاق الحمض النووي لتحليله في اتجاه مجرى النهر.

البروتوكول

1. Native chromatin immunoprecipitation (ChIP)

1. Chromatin preparation
   1. بعد عمل مخزون من خلايا الغلاف العصبي المشتقة (NS) ، قم بزراعة NS في قارورة T-75 في 15 مل من وسط NSC عند 37 درجة مئوية في حاضنة لزراعة الأنسجة بجو 95٪ هواء و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ حتى تصبح NS ملتقية. ستنتج لوحة T-75 المتقاربة 3-5 × 10⁶ خلايا.
   2. ....

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = 'collapse border: collapse ؛ font-family: Calibri ؛ حجم الخط: 11pt ؛ تخطيط الجدول: ثابت ؛ 'cellpacing = '0' cellpadding = '0' dir = 'ltr' border = '1' data-sheets root = '1' data-sheets baot = '1'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2946-90004bioanalyzerAccuSpin Micro 17R ، المبردة < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden; padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom;'>Fisher Scientific13-100-676< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> C57BL / 6TaconicB6-fC57BL / 6 mouse< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> calcium كلوريد Aldrich22350-6buffer reagentD-Luciferin, ملح البوتاسيومGoldbioLuckK-1gDiaMag1.5 magnetic rackDiagenodeB04000003for magnetic bead washesDiaMag Rotator EUDiagenodeB05000001rotatorDMEM / F-12Gibco11330-057NSC componentDynabeads Protein AThermo Fisher Scientific10001D< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;boardding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>protein A المغناطيسية الخرزDynabeads Protein GThermo Fisher Scientificprotein G المغناطيسية الخرزEGFAF-100-15 قم بإعداد مخزون 20 ميكروغرام/مل في 0.1٪ BSA وحصة.Ethylenediaminetetraacetic acid acid (EDTA)Sigmabuffer reagent ethylene glycol-bis (β-aminoethyl ether)-N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA)< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>SigmaE-4378buffer reagent< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Fetal Bovine SerumGibco10437028for frozen cells< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>FGFPeproTech100-18b< td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> قم بإعداد 20 ميكروغرام / مل من المخزون في 0.1٪ BSA و aliquot.CouppsFine Science Tools11008-13for تشريح الورمالجلسرين ، ميغابايت الصف < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom;'>EMD- Millipore356352 HBSSGibco14175-103 متوازن salt solution< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>FlurisoVETone501017< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> استنشاق مخدرIvis SpectrumPerkin-Elmer< نمط TD = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛' >124262 < نمط TD = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> في الجسم الحي نظام التصوير البصري < نمط tr = 'الارتفاع: 19 بكسل ؛' >< نمط TD = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليسرى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الفائض: مخفي. الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ >HyqtaseHyClonSV3003001cell detachment mediaLithium ChlorideSigmaL8895buffer reagentالأنابيب الدقيقة منخفضة الربط < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom;'>Corning Costar < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '>CLS3207 < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '>low أنبوب الطرد المركزي الدقيق ملزمة البروتين < نمط TR = 'الارتفاع: 19 بكسل ؛ '>< نمط TD = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليسرى : 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>أنبوب الطرد المركزي الدقيق < نمط TD = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ > فيشر< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>21-402-903normal microcentrifuge tubeMicrococcal NucleaseThermo Fisher Scientific, Affymetrix70196YN2Gibco17502-048NSC componentNormocinInvivogenNOL-36-063 عامل مضاد للميكروبات، استخدم عند 0.1 ملغم/مل.NP-40 (Igepal CA-630)Sigma18896-50MLbuffer reagentKimble Kontes Pellet Pestle < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> Fisher Scientific < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '>K749515-0000< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> protease Inhibitor CocktailSigma-AldrichP8340aliquot and storage at -20 °C.protinase KSigma-Aldrich< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>P2308make 10 mg/ml مخزون في الماء؛ aliquot وتخزينها عند -20 °C.QIAquick PCR Purification KitQiagen28104the DNA purification kit< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>ScalpelFine Science Tools10007-16for تشريح الورمكلوريد الصوديوم < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>VWR < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ حشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> 0241-5KG كاشف العازلةSodium DeoxycholateSigma-AldrichD670-25Gbuffer reagentكبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ blockding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom;'>SigmaL-4390buffer reagentTris BaseThermo Fisher ScientificBp152-1buffer reagent< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Triton X-100Thermo Fisher Scientific< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>BP 151-500polyethylene glycol octylphenyl etherجهاز الطرد المركزي القياسي الصغير< نمط td = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> فيشربراند < td النمط = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> 12-006-901 < نمط TD = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>جهاز الطرد المركزي الصغير القياسي < نمط TD = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليسرى: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> SZX16 المجهر < نمط TD = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>أوليمبوسSZX16fluorescent dissecting microscopeNanodrop OneThermo-Fisher ScientificND-ONEC-W