إجراء التهجين المزدوج في الموقع للكشف عن التعبير الجيني في أقسام دماغ الفئران

الملخص

المصدر: جولي، س.، et.al. الجمع بين التألق المزدوج في الموقع التهجين مع الملصقات المناعية للكشف عن التعبير عن ثلاثة جينات في أقسام دماغ الفأر. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو استخدام التألق المزدوج في التهجين في الموقع لتصور التعبير عن هدفين من الحمض النووي الريبي في أقسام دماغ الفأر. يتضمن البروتوكول الكشف المتسلسل عن الحمض النووي الريبي باستخدام مجسات مصنفة بفلوريسين إيزوثيوسيانات وديجوكسيجينين ، متبوعا بتضخيم الإشارة الأنزيمية لتعزيز الحساسية. يتيح التألق الناتج تحليل التوطين المشترك للحمض النووي الريبي المستهدف داخل الأنسجة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. التهجين

1. < نمط الامتداد = 'لون الخلفية: شفاف ؛ اللون: #1a202c ؛ '> تحضير 65 درجة مئوية المخزن المؤقت للغسيل: 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 15 ملي أمبير_{Na 3}C₃H₅O (COO) ₃ (= 1x سترات الصوديوم المالحة) ، 50٪ (v / v) فورماميد و 0.1٪ (v / v) Tween-20.
2. تحضير المخزن المؤقت MABT: 100 ملي مولار حمض الماليك ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.1٪ (حجم / حجم) توين -20 ، درجة الحموضة 7.5.
3. تمييع المجسين (المسمى DIG والمسمى FITC) 1/1,000 في المخزن المؤقت للتهجين (ماء منزوع الأيونات المعالج ب DEPC مع 50٪ (حجم / حجم) فورماميد منزوع الأيونات ، 200 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي مولار EDTA ، 10 ملي مولار Tris-HCl الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 5 ملي هيدروكلوريك هيدروكلوريك₂PO₄ ، 5 ملي Na₂HPO₄ ، 0.01 مجم / مل خميرة tRNA ، 1× محلول Denhardt ، و 10٪ وزن / حجم كبريتات ديكستران) تم تسخينها مسبقا إلى 65 درجة مئوية وتخلط جيدا.
4. ضع حوالي 300 ميكرولتر من خليط التهجين على كل شريحة ، وغطيها بأغطية مخبوزة بالفرن (200 °C) واحتضان O / N عند 65 درجة مئوية في غرفة رطبة.
5. انقل الشرائح إلى وعاء Coplin يحتوي على مخزن غسيل مسخن مسبقا. اغسل الشرائح لمدة 30 دقيقة مرتين عند 65 درجة مئوية باستخدام محلول الغسيل.
6. اغسل الشرائح لمدة 10 دقائق ثلاث مرات باستخدام MABT في RT.

2. تصور FITC Probe

1. Prepare ISH blocking buffer: MABT مع كاشف حجب 2٪ ومصل أغنام معطل للحرارة.
2. اختياري: استخدم قلما مسعورا لرسم دوائر حول أقسام الأنسجة على الشريحة لتقليل حجم محاليل الأجسام المضادة المطلوبة.
3. احتضان الشرائح لمدة 1 ساعة في RT مع المخزن المؤقت لحجب ISH في غرفة رطبة.
4. احتضان الشرائح O / N عند 4 درجات مئوية باستخدام بيروكسيداز الفجل (POD) - الجسم المضاد المترافق المضاد ل FITC المخفف 1/500 (v / v) في المخزن المؤقت لمنع ISH.
5. ضع الشرائح في جرة Coplin تحتوي على PBS مع 0.1٪ (حجم حجمي) Tween-20 (PBST). اغسل 3 مرات لمدة 10 دقائق في PBST واستبدلها ب PBST طازج في كل مرة.
6. مباشرة قبل الاستخدام، قم بإعداد التيراميد الفلوري عن طريق التخفيف 100 مرة في مخفف التضخيم. على سبيل المثال، استخدم FITC-tyramide.
7. أضف هذا إلى الشرائح واتركه لمدة 10 دقائق في RT.
8. ضع الشرائح في برطمان Coplin واغسلها 3 مرات في PBST لمدة 10 دقائق.

3. تصور DIG Probe

1. Prepare 0.1M Tris- HCl pH 8.2.
2. احتضان الشرائح باستخدام المخزن المؤقت لحظر ISH لمدة 1 ساعة في RT.
3. احتضان الشرائح O / N عند 4 درجات مئوية باستخدام جسم مضاد مضاد مضاد للفوسفاتيز القلوي (AP) مخفف 1 / 1,500 (v / v) في المخزن المؤقت لحجب ISH.
4. يغسل باستخدام MABT لمدة 10 دقائق ثلاث مرات.
5. اغسل مرتين باستخدام 0.1 M Tris-HCl pH 8.2 لمدة 5 دقائق في RT.
6. مباشرة قبل الاستخدام، قم بإعداد محلول Fast Red عن طريق إذابة الأقراص في 0.1 M Tris pH 8.2. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
7. احتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية بمحلول Fast Red في غرفة رطبة. نظرا لاختلاف وقت التطور الأمثل ، تحقق من الشرائح بانتظام باستخدام مجهر الفلورسنت لمراقبة تكوين الرواسب. في هذا المثال ، أوقف التفاعل بعد 2-3 ساعات.
8. Wash باستخدام PBST لمدة 10 دقائق ثلاث مرات.

المواد

< فئة الشكل = نمط الجدول = 'العرض: 587 نقطة ؛ '><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> < col style = 'العرض: 37.65٪ ؛ '>< col style = 'width: 20.78٪ ؛ '>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td style = 'border-top-style: none ؛ height: 15.75pt ؛ width: 221pt ؛ '>Superfrost plus slides < td style = 'border-left-style: none ؛ border-top-style: none ؛ width: 135pt ؛ '> Thermo Scientific< td style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:109pt;'>J1800AMNZ Sodium citrateSigmaS4641ل 65 درجة مئوية المخزن المؤقت للغسيل < td style = 'border-top-style: none ؛ height: 15.75pt ؛ width: 221pt ؛ '>FormamideSigma-Aldrich < td style = 'border-left-style: none ؛ border-top-style: none ؛ width: 109pt ؛ '>F7503 < td style = 'border-left-style: none ؛ border-top-style: none ؛ width: 122pt ؛ '> Tween-20Sigma-AldrichP1379 CoverslipsVWR International631-0146 Coplin JarSmith-Scientific Ltd2959 Blocking reagentRoche11096176001 مصل الأغنام المعطل بالحرارةSigmaS2263 Hydroblobic PenCosmo BioDAI-PAP-S09:20α-FITC POD-contrgated antibody Roche11426346910 TSA™ Plus Fluorescein SystemPerkin ElmerNEL741001KT26:00:00α-DIG AP-conjugatedRoche11093274910 Fast Red TabletsRoche11496549001 Mounting mediumDakoS3023 Leica SP2 confocal microscopeLeica .22 μM filter Millex SLGP033RS formamide Deionized Sigma F9037 for ISH blocking bufferSodium chloride Sigma S3014 Hydrochloric acid VWR International20252.29 Sodium phosphate monobasic
anhydrousSigma S8282 ثنائي هيدرات فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة Sigma 30435 Yeast tRNA Roche 10109495001 50x Denhardt's solution Life Technologies 750018Dextran sulfateSigma D8906 Sodium acetate SigmaS2889 Trizma Base Sigma T1503