تلطيخ التألق المناعي للأنسجة الوعائية الليفية المريضة المشتقة من المريض المضمنة في الهلام

الملخص

المصدر: Gucciardo, E., et. al. ، نموذج لزراعة الأنسجة خارج الجسم الحي لمضاعفات الأوعية الدموية الليفية في اعتلال الشبكية السكري التكاثري. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو تفاصيل بروتوكول التلوين المناعي لثقافات خارج الجسم الحي للأنسجة الوعائية الليفية المضمنة في هلام الفيبرين. يتيح ذلك التصور التفصيلي للتغيرات الوعائية المرتبطة باعتلال الشبكية السكري التكاثري

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات مجلس المراجعة المؤسسية للمعهد.

1. تلطيخ التألق المناعي الكامل

ملاحظة: يستمر هذا البروتوكول لمدة 5 أيام ويمكن مقاطعته مع الحضانات الليلية حيثما هو محدد. لا تدع جل الفيبرين يجف في أي وقت. يتم تنفيذ جميع الخطوات في RT ما لم يذكر خلاف ذلك.

1. قم بإعداد الحلول التالية قبل البدء في بروتوكول التلوين.
   1. محلول ما بعد التثبيت: تحضير محلول الأسيتون: الميثانول بنسبة 50:50 عن طريق خلط كميات متساوية من الأسيتون والميثانول ( على سبيل المثال ، 50 مل). يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية. قم بإعداد هذا المحلول في اليوم السابق للتلطيخ. يمكن تخزين هذا المحلول مرة أخرى عند -20 درجة مئوية واستخدامه في البقع اللاحقة.
      ملاحظة : قم بإعداد هذا المحلول في غطاء الدخان لأن الأسيتون والميثانول قابلان للاشتعال وخطران على الصحة.
   2. محلول الحظر: تحضير مصل بقري جنيني بنسبة 15٪ (FBS) ، محلول إيثوكسيلات أوكتيل فينول 0.3٪ في PBS عن طريق إضافة 15٪ FBS أولا إلى PBS. يضاف إيثوكسيلات الفينول أوكتيل ويحرك حتى يذوب. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن تحضير هذا المحلول بكميات كبيرة مسبقا، وتخزينه في 15 مل عند -20 درجة مئوية، وإذابته قبل الاستخدام في اليوم الذي يبدأ فيه بروتوكول التلوين. استخدم الأجزاء المحضرة حديثا أو المذابة حديثا لكل بروتوكول تلطيخ.
   3. محلول الغسيل: قم بإعداد 1 لتر من PBS مكملا بنسبة 0.45٪ أوكتيل فينول إيتوكسيلات عن طريق إضافة 4.5 مل من إيثوكسيلات أوكتيل فينول إلى 995.5 مل من PBS. يقلب حتى يذوب. يخزن في RT.
2. ارفع القطرات بعناية من اللوحة باستخدام ملعقة مربعة الحواف من الفولاذ المقاوم للصدأ. افصل القطرة أولا عن الحواف قبل رفع المركز ، وانقلها إلى بئر من 12 بئرا تحتوي على 1 مل من PBS.
   ملاحظة: قم بإجراء خطوات ما بعد التثبيت والغسيل والحظر في تنسيق اللوحة هذا.
3. بعد إصلاح القطرات ب 1 مل من محلول الأسيتون المثلج 50:50: محلول الميثانول لمدة ~ 1 دقيقة (ستتحول حدود القطرات إلى اللون الأبيض).
   ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان لأن الأسيتون والميثانول يشكلان خطورة على الصحة.
4. اشطفها ب 3-5 غسلات في 2 مل من PBS (ستغرق القطرات في محلول PBS عند اكتمال الجفاف).
   ملاحظة: تجنب لمس القطرات بطرف الماصة لأنها تلتصق بالبلاستيك بعد التثبيت. طوال البروتوكول ، تجنب شفط محاليل ما بعد الإصلاح والأجسام المضادة والحجب والغسيل عن طريق الشفط ، لأن ذلك قد يؤدي إلى إتلاف القطرات أو تدميرها تماما. بدلا من ذلك، قم بإمالة اللوحة وإزالة المحاليل بعناية باستخدام ماصة سعة 500-5,000 ميكرولتر.
5. الطرد المركزي محلول الحجب لمدة 15 دقيقة عند 21,000 × جم و 4 درجات مئوية من أجل إزالة الحطام.
   ملاحظة: يمكن اقتباس المحلول في أنابيب 1.5 مل للطرد المركزي. يمكن تخزين المحلول غير المستخدم عند 4 درجات مئوية واستخدامه في جميع الخطوات اللاحقة ذات الصلة.
6. احتضان القطرات في محلول حجب 500 ميكرولتر لمدة ساعتين في RT.
   }ملاحظة: لتقليل حجم محلول الحجب المستخدم ، يمكن إمالة اللوحة على دعامة ويمكن استخدام أقل من 300 ميكرولتر من المحلول / القطرة.
7. تحضير خليط الأجسام المضادة الأولية (30 ميكرولتر / قطرة على الأقل) عند التخفيف المناسب في محلول الحجب وجهاز الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 21,000 × جم و 4 درجات مئوية.
8. انقل القطرات إلى صفيحة دائرية (U) قاع 96 بئرا باستخدام ملعقة مستديرة الحواف ، واحتضانها بما لا يقل عن 30 ميكرولتر / قطرة من خليط الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية.{{TAG_ 99}}
9. في اليوم التالي ، انقل القطرات إلى طبق مكون من 12 بئرا يحتوي على 2 مل من محلول الغسيل / البئر ، واشطفها بثلاث غسلات لمدة 5 دقائق أولا ثم بتسع غسلات لمدة 30 دقيقة. اترك الغسيل الأخير (2 مل) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
10. في اليوم التالي ، اشطفه ثلاث مرات باستخدام PBS وانقل القطرات إلى طبق دائري (U) قاع 96 بئر.
11. أثناء الغسيل، قم بإعداد خليط الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور المناسب (مخفف 1:500، على الأقل 30 ميكرولتر/قطرة) في محلول مانع وجهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 21,000 × جم و 4 درجات مئوية.
12. نقل القطرات إلى صفيحة مستديرة (U) ذات 96 بئرا باستخدام ملعقة مستديرة الحواف واحتضانها بما لا يقل عن 30 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الثانوية. لمدة 4 ساعات في RT ، محمية من الضوء.
    ملاحظة: قم بإجراء جميع عمليات الحضانة اللاحقة وخطوات الغسيل المحمية من الضوء.
13. انقل القطرات إلى طبق مكون من 12 بئرا يحتوي على 2 مل من محلول الغسيل / البئر باستخدام ملعقة مستديرة الحواف ، اشطفها بثلاث غسلات لمدة 5 دقائق أولا ثم بأربع غسلات لمدة 30 دقيقة. اترك الغسيل الأخير (2 مل) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
14. في اليوم التالي ، اشطف المواد الهلامية بخمس غسلات لمدة 30 دقيقة ثم ثلاث مرات باستخدام PBS. اترك الغسيل الأخير (2 مل) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
15. في اليوم التالي ، انقل القطرات إلى صفيحة دائرية (U) ذات 96 بئرا باستخدام ملعقة مستديرة الحواف ونواة مضادة للبقع عن طريق الحضانة بصبغة Hoechst النووية 10 ميكروغرام / مل (30 ميكرولتر على الأقل / قطرة) لمدة 30 دقيقة في RT.
    ملاحظة: يمكن بدلا من ذلك استخدام وسيط التركيب المكمل ب 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) لتلطيخ النوى. في هذه الحالة، يتم تخطي هذه الخطوة والخطوة 1.16، والانتقال مباشرة إلى الخطوة 1.17.
16. انقل القطرات إلى صفيحة من 12 بئرا تحتوي على 2 مل من PBS / بئر باستخدام ملعقة مستديرة الحواف واشطفها ثلاث مرات باستخدام PBS.
17. قم بتركيب القطرات على شريحة المجهر على النحو التالي:
    1. ضع طبقة ضيقة من وسط التثبيت سريع التصلب على حواف غطاء زجاجي مربع الشكل 22 مم × 22 مم واتركه يجف لمدة ~ 1 دقيقة. قم بتنفيذ هذه الخطوة لكل قطرة على حدة ، لتجنب التصلب المفرط لوسط التثبيت.
       ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان لأن وسيط التثبيت سريع التصلب يشكل خطورة على الصحة.
    2. اشطف القطرة عن طريق غمسها في بئر من صفيحة مكونة من 12 بئرا تحتوي على 2 مل من الماء منزوع الأيونات وانقلها إلى شريحة مجهرية باستخدام ملعقة مستديرة الحواف. قم بإزالة الماء الزائد باستخدام قطعة صغيرة من الورق الماص.
    3. قم بتوزيع 15 ميكرولتر من وسط التثبيت المضاد للبهتان غير المتصلب على القطرة.
       ملاحظة: بدلا من ذلك ، إذا لم يتم استخدام صبغة Hoechst النووية ، فيمكن استخدام وسيط التركيب الذي يحتوي على 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
    4. ضع زجاج الغطاء برفق ، بحيث يكون وسط التثبيت سريع التصلب مواجها للشريحة المجهرية ، فوق القطرة واتركها تستقر.
       ملاحظة: سوف يلتصق وسط التصلب السريع بالشريحة المجهرية ويحافظ على القطرة في مكانها.
18. كرر الخطوة 1.17 لجميع القطرات. قم بتركيب قطرتين على كل شريحة مجهرية.
19. دع الشرائح تجف في الهواء عند RT لمدة ~ 2 ساعة وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل. تأكد من وضع الشرائح أفقيا ومحمية من الضوء.
20. قم بتصوير مزارع FT ex vivo الأصلية أو النقطة النهائية الملطخة باستخدام مجهر متحد البؤر أو مجهر متألق عمودي مزود بوظيفة التقسيم البصري وهدف 20x أو 40x. استخدم وظيفة البلاط لالتقاط مساحة أكبر من الأنسجة في وقت واحد.

المواد

<فئة الشكل = نمط "الجدول" = "العرض: 693pt;'>< td style = 'width: 174pt;'>Menzel / Fisher< نمط TD = 'العرض: 194pt;'>تستخدم للتركيب<نمط td = 'الارتفاع: 39.5pt ؛ العرض: 165pt ؛ '>Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) < td style = 'width: 174pt ؛ '>Sigma-Aldrich < td style = 'width: 160pt ؛ '>T9284 < td style = 'width: 194pt ؛ '> يستخدم للتألق المناعي الكامل. ضار: ارتد قفازات واقية و / أو ملابس.td style='width:194pt;'>for hydroting nucles. ضار: ارتد قفازات و / أو ملابس واقية ، وحماية العين و / أو الوجه.< td style = 'الارتفاع: 39.5pt ؛ العرض: 165pt ؛ '>Eukitt وسط التثبيت السريع < td style = 'العرض: 174pt ؛ '> Sigma-Aldrich < td style = 'العرض: 160pt ؛ '> 03989-100ml < td style = 'width: 194pt ؛ '> TOXIC: ارتد قفازات و / أو ملابس واقية ، وحماية العين. استخدم في غطاء الدخان.< نمط TD = 'الارتفاع: 14.5pt ؛ العرض: 165pt;'>VEGFA البشري المؤتلف<td style='العرض:174pt;'>R&D Systems النهائي < td style = 'العرض: 160pt ؛ '>GF346 < td style = 'العرض: 194pt ؛ '>1 نانوغرام / مل التركيز النهائي < td style = 'الارتفاع: 14.5pt ؛ العرض: 165pt ؛ '> المؤتلف البشري bFGF < td style = 'width: 174pt ؛ '>Millipore < td style = 'width: 160pt ؛ '>01-106 < td style = 'width: 194pt ؛ '> ng / mL التركيز النهائي < td style = 'الارتفاع: 26.5 نقطة ؛ العرض: 165 نقطة ؛ '>CD31 (JC70A)< td style='العرض:174pt;' >Dako<نمط td = 'العرض: 174pt ؛' >Dako < td style = 'width: 160pt ؛ '>AF2089 < td style = 'width: 194pt ؛ '> يستخدم عند 1: 100 التخفيف ، الحمار المضاد للماعز Alexa 568 الثانوي Ab < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 165pt ؛ '>NG2 < td style = 'العرض: 174pt ؛ '>Millipore < td style = 'width: 160pt ؛ '>AB5320< td style='العرض: 160pt;' >A-21202< نمط td = 'العرض: 160pt ؛ '>A-11057< td style='width:160pt;'>A-21468td style='height:15.75pt;width:165pt;'>AxioImager.Z1 up-fluorscope with Apotome FT

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Material
Cell Culture Plate, 96-well, U-bottom	Greiner Bio-One	392-0019	used for the full mount immunofluorescence
ملاعق مستديرة / مسطحة، فولاذ مقاوم للصدأ	VWR	82027-528	used for monofluorescence immune mount full-mount
Coverslips 22x22mm # 1	15727582	used for mounting
Microscope slides	Fisher	Kindler K102	used for mounting
Absorbent Paper	VWR	115-0202
PBS tablets	Medicago	09-9400-100	used for preparation 1x PBS
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-2.5L-M	تستخدم لتحضير محلول ما بعد التثبيت. ضار: ارتد قفازات واقية و / أو ملابس. استخدم في غطاء الدخان.
Methanol	Sigma-Aldrich	32213	used to preparation after fixation. سامة: ارتد قفازات واقية و / أو ملابس. استخدم في غطاء الدخان.
Hoechst 33342, 20mM	Life Technologies	62249<
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	ارتد قفازات واقية و/أو ملابس واقية وحماية العين. استخدم في غطاء الدخان.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Mounting medium with counterting nuclees. ارتد قفازات واقية و / أو ملابس واقية وحماية للعين. استخدم في غطاء الدخان.
293-VE-010	50 ng / mL التركيز
reampinant human VEGFC	R&D Systems	752-VC-025	200 ng / mL التركيز النهائي
نمط TGFβ	= 'العرض: 174pt ؛ '>Millipore
Dako	M0823	used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10)	Dako	M716501-2	used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26)	M070129-2	used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68	ImmunoWay	RLM3161	used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cparkd caspase-3 (5A1E)	Cell Signalling	9664	used at 1:200 dilution, goat anti rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111)	Dako	M731429-2	used at 1:100 diiltion, goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAP	Z0334	used at 1:100 dilution, goat anti rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67	Leica Microsystems	NCL-Ki67p	used at 1:1500 dilution, goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1	أنظمة البحث والتطوير
يستخدم عند تخفيف 1: 100 ، الماعز المضاد للأرانب Alexa 594 الثانوية Ab
Prox1	ReliaTech	102-PA32	تستخدم عند 1:200 التخفيف ، الماعز المضادة للأرانب Alexa 568 الثانوية Ab
Prox1	R&D Systems	AF2727	used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9)	Millipore	MAB3757	used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4)	Sigma	C6198	used at 1:400 dilution, Cy3 conrupgated
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG	Life Technologies	used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	A-11012	used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Donkey Anti-Goat IgG	Thermo Scientific	used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Goat Anti-Rabbit IgG	Thermo Scientific	A-11036	used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG	Molecular Engines	used at 1:500 dilution
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopes
Axiovert 200 مجهر epifluorescence المقلوب	Zeiss		For imaging of the new and embedded fibrin ft<
Zeiss		for imaging of the full immunoed immuno