تلطيخ المناعة للخلايا العصبية في شرائح دماغ الفأر بعد التهجين الموضعي

الملخص

المصدر: Baleriola, J., et . al. ، الكشف عن mRNAs المترجمة محوريا في أقسام الدماغ باستخدام التهجين في الموقع عالي الدقة. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو اكتشاف mRNA داخل المحاور الكولينية في شرائح الحصين الثابتة للفأر باستخدام تهجين الفلورسنت في الموقع وتلوين الأجسام المضادة. يكشف المجهر الفلوري عن التوطين المكاني ل mRNAs الموسومة بالمسبار وأستيل ترانسفيراز الكولين في الخلايا العصبية كولينية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. مقايسة FISH متبوعة بالكيمياء المناعية باستخدام مستضد / RNA الناجم عن الحرارة
   1. قبل البدء ، قم بإعداد جميع المواد المطلوبة:
      1. سخني فرن التهجين إلى 40 درجة مئوية وضعي صينية تحتوي على ماء مقطر في الفرن لخلق بيئة رطبة.
      2. خذ صندوقا منزلقا وضع مناشف ورقية مبللة بالماء المقطر بالداخل لترطيبها. ثم ضع صندوق الشرائح في فرن التهجين.
      3. قم بإزالة المجسات (المجسات السالبة والمستهدفة) من الثلاجة وقم بتسخينها في فرن التهجين لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، دع المجسات تبرد في RT.
      4. كواشف تضخيم التوازن AMP 1-4 (مضمنة في مجموعة كاشف تعدد الإرسال الفلوري) في RT.
      5. تحضير محلول استرجاع المستضد: 10 ملي مولار سترات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6) ، 0.05٪ توين 20. }ملاحظة: يمكن تخزين المحلول في RT إلى أجل غير مسمى واستخدامه للتلوين في المستقبل.
      6. قم بإعداد 1x مخزن غسيل يخفف محلول المخزون 50x (في مجموعة الكاشف المتعدد الفلورسنت) في المياه الخالية من RNase أو المعالجة DEPC.
         ملاحظة: يمكن تخزين 1x المخزن المؤقت للغسيل في RT لمدة شهر واحد واستخدامه للتلوين في المستقبل. قد يترسب المخزن المؤقت للغسيل 50x. إذا كان الأمر كذلك ، فقم بتسخين محلول الغسيل 50 ضعفا عند 40 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل تحضير محلول 1x.
   2. قم بإزالة الشرائح من الإيثانول بنسبة 100٪ وجففها في الهواء لمدة 5 دقائق في RT.
   3. قم بإعداد برطمان كوبلين يحتوي على 50 مل من محلول استرجاع المستضد. اغمر الشرائح في محلول استرجاع المستضد واغليها لمدة 10 دقائق في فرن الميكروويف.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، ضع الشرائح أفقيا في طبق زجاجي دائري بقطر 100 مم يحتوي على 100 مل من محلول الاسترجاع.
      1. املأ دورق سعة 1 لتر بالماء المقطر وضعه في الميكروويف.
         ملاحظة: سيقوم الماء "بتخزين الحرارة" عند إجراء إزالة القناع.
      2. ضع الشرائح في محلول استرجاع المستضد داخل الميكروويف. تغلي الشرائح بقوة عالية لمدة 5 دقائق. مباشرة بعد توقف العينات عن الغليان ، تنزلق الحرارة مرة أخرى بقوة عالية لمدة 5 دقائق إضافية.
      3. قم بتبريد الشرائح في RT.
         ملاحظة: خطوة حرجة: يجب تحديد مدة الغليان وإجراءه من قبل المستخدم ، اعتمادا على خصائص الميكروويف. كلما بدأ الغليان بشكل أسرع ، زادت فرص تبخر المحلول. في هذه الحالة ، يوصى بغلي العينات لفترات زمنية أقصر أكثر من مرتين لإكمال وقت الكشف الإجمالي البالغ 10 دقائق. على العكس من ذلك ، إذا تم إجراء التسخين بطاقة متوسطة أو منخفضة ، فيمكن إجراء الكشف مرة واحدة لمدة 10 دقائق. ومع ذلك ، إذا لم تغلي العينات بشكل مستمر لمدة 10 دقائق تقريبا ، فقد يؤدي ذلك إلى الكشف الجزئي عن كل من الحمض النووي الريبي المستهدف والبروتين المراد اكتشافه.
   4. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام 1x PBS.
   5. أضف 2-3 قطرات (~ 100 ميكرولتر) من dapB مجموعة إلى شرائح الدماغ المستخدمة لتقييم تلطيخ الخلفية. ملاحظة: تستهدف مجموعة المسبار dapB جينا بكتيريا ويجب ألا تتعرف على أي حمض مضمض رمبي للثدييات.
   6. أضف 2 - 3 قطرات من مجموعة مسبار الاستهداف إلى شرائح الدماغ المستخدمة لاكتشاف الحمض النووي الريبي محل الاهتمام. ملاحظة: يتم استخدام مجموعة مسبار تستهدف بقايا 20 - 1,381 من الفأر Atf4 mRNA في هذا المثال.
   7. قم بتغطية الشرائح بالبارافيلم لتجنب تبخر المسبار ، وضعها في صندوق الشرائح المرطب داخل فرن التهجين ، واحتضانها عند 40 درجة مئوية لمدة ساعتين.
      NOTE: اختياري: يمكن تهجين شرائح الدماغ الإضافية باستخدام مجموعة مسبار تستهدف الماوس Polr2A واستخدامها كعناصر تحكم إيجابية.
   8. اغسل الشرائح مرتين باستخدام مخزن مؤقت للغسيل 1x لمدة دقيقتين في RT.
   9. أضف 2 - 3 قطرات من كاشف التضخيم AMP 1-FL إلى كل شريحة دماغية ، وقم بتغطية الشرائح بالبارافيلم ، وضعها في صندوق الشرائح ، واحتضانها عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في فرن التهجين.
   10. اغسل الشرائح مرتين باستخدام مخزن مؤقت للغسيل 1x لمدة دقيقتين في RT.
   11. أضف 2-3 قطرات من كاشف التضخيم AMP 2-FL إلى كل شريحة دماغية ، وقم بتغطية الشرائح بالبارافيلم ، وضعها في صندوق الشرائح واحتضانها عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في فرن التهجين.
   12. اغسل الشرائح مرتين باستخدام مخزن مؤقت للغسيل 1x لمدة دقيقتين في RT.
   13. أضف 2-3 قطرات من كاشف التضخيم AMP 3-FL إلى كل شريحة دماغية ، وقم بتغطية الشرائح بالبارافيلم ، وضعها في صندوق الشرائح واحتضانها عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في فرن التهجين.
   14. اغسل الشرائح مرتين باستخدام مخزن مؤقت غسيل 1x لمدة دقيقتين في RT.
   15. أضف 2-3 قطرات من كاشف التضخيم AMP 4-FL إلى كل شريحة دماغية ، وقم بتغطية الشرائح بالبارافيلم ، وضعها في صندوق الشرائح واحتضانها عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في فرن التهجين.
   16. اغسل الشرائح مرتين باستخدام مخزن غسيل 1x لمدة دقيقتين في RT ومرتين باستخدام 1x PBS.
   17. أضف 100 - 200 ميكرولتر (أو حجم كاف لتغطية الشرائح بالكامل) من محلول مانع يحتوي على 3 مجم / مل BSA و 100 ملي مولار جلايسين و 0.25٪ تريتون X-100 في PBS (درجة الحموضة 7.4) إلى الشرائح ، وقم بتغطيتها بالبارافيلم ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة في RT.
   18. أضف 100 - 200 ميكرولتر من الجسم المضاد ل ChAT المخفف في محلول مانع (1/100) إلى الشرائح ، قم بتغطيتها بالبارافيلم ، واحتضانها لمدة يومين عند 4 درجات مئوية. تأكد من عدم جفاف شرائح الدماغ. إذا لزم الأمر ، أعد تطبيق محلول الأجسام المضادة ل ChAT على شرائح الدماغ بعد 24 ساعة من الحضانة.
   19. اغسل الشرائح ثلاث مرات في 1x PBS لمدة 5 دقائق في RT.
   20. أضف 100 - 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المناسب مع Alexa ( على سبيل المثال .، Alexa-594 Donkey Anti-goat لهذا المثال بالذات) إلى الشرائح ، وقم بتغطيتها ببارافيلم ، واحتضانها لمدة ساعة واحدة في RT.
   21. اغسل الشرائح ثلاث مرات في 1x PBS لمدة 5 دقائق في RT.
   22. اغسل الشرائح مرة واحدة بالماء المقطر.
   23. قم بتركيب الشرائح بوسيط تركيب يحتوي على DAPI.
   24. تخيل شرائح الدماغ تحت المجهر الفلوري.

المواد

<فئة الشكل = نمط الجدول = 'العرض: 540 نقطة ؛ '><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>< col style = 'width: 26.3٪ ؛ '>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مسبار مخصص يستهدف المخلفات 20-1381 من الماوس Atf4 mRNA (NM_009716) < td style = 'width: 139pt ؛ '> Advanced Cell Diagnostics < td style = 'width: 114pt ؛ '>-< td style = 'width: 142pt ؛ '> probeمسبار مخصص يستهدف المخلفات 15-1256 من ATF4 mRNA البشري (NM_001675.2)Advanced Cell Diagnostics-ProbeNegative control probe-DapBAdvanced Cell Diagnostics310043 Probe< td style='height::29.0pt ؛ العرض: 145pt ؛ '> مسبار التحكم الإيجابي Polr2A (اختياري) < td style = 'width: 139pt ؛ '>Advanced Cell Diagnostics < td style = 'text-align: right; width: 114pt ؛ '>312471 Probe الماعز متعدد النسيلة المضاد للجسم المضاد ل ChAT < td style = 'العرض: 139pt ؛ '>Millipore < td style = 'width: 114pt ؛ '>AB144P < td style = 'width: 142pt ؛ '> < td style = 'الارتفاع: 29.0pt ؛ العرض: 145pt ؛ ' >وسيط تركيب ProLong Gold مع نمط DAPILife Technologies < td style = 'width: 114pt ؛ '>P36935 < td style = 'width: 142pt ؛ '> < td style = 'height: 43.5pt ؛ width: 145pt ؛ '> RNAscope Fluorescent Multi Reagent Recode Kit (للكشف عن التألق ) < td style = 'width: 139pt ؛ '>Advanced Cell Diagnostics < td style = 'width: 114pt ؛ '> 320850 < td style = 'width: 142pt ؛ '> in situ situ hybrid kit