تصوير عالي الدقة لمستقبلات الناقلات العصبية في نقاط الاشتباك العصبي في شبكية العين

الملخص

المصدر: Zhang، J.، et al. تحليل الذهب المناعي الكمي عالي الدقة لمستقبلات الغشاء في نقاط الاشتباك العصبي الشريطية في شبكية العين. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو تقنية مجهر إلكتروني لتصور توطين مستقبلات الناقل العصبي في نقاط الاشتباك العصبي. تحتوي أقسام الشبكية على خلايا عقدية شبكية تظهر مستقبلات ناقلات عصبية مرتبطة بالغشاء ويتم تصنيفها بالوحدة الفرعية لسم الكوليرا B (CTB). عند تسمية العلامات بالأجسام المضادة المترافقة مع الجسيمات النانوية الذهبية وتلوين القسم بالمعادن الثقيلة ، يتم تصور مستقبلات RGC تحت المجهر.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. تثبيت أنسجة الشبكية

1. قم بتجميع المواد والأدوات التالية: مجهر تشريح ، ملقطان بأطراف دقيقة جدا ، مقص ، ورق ترشيح السليلوز ، ماصة بلاستيكية وشريحة مجهر.
2. قم بتخدير الجرذ في غرفة مغلقة باستخدام 2.0 مل من الهالوثان (مخدر مستنشق). تحديد التخدير الكافي بهذه الطرق: عدم انسحاب المخلب الخلفي بعد قرصة إصبع القدم ، أو عدم وجود رد فعل وميض. ثم قطع الرأس على الفور بالمقصلة. قم بإزالة العينين بمقص القزحية وضعه في طبق زجاجي يحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد في 0.1 متر من الفوسفات المؤقت (PB) عند درجة الحموضة 7.4.
3. باستخدام مجهر التشريح ، قم بإزالة القرنية عن طريق قطع الجزء الأمامي من مقلة العين. قم بإزالة العدسة والجسم الزجاجي من سطح الشبكية الداخلي باستخدام الملقط.
4. قشر الصلبة بالملقطين حتى يتم عزل شبكية العين عن كوب العين.
5. قطع شبكية العين على الفور إلى شرائح بسمك 100 - 200 ميكرومتر باستخدام ماكينة حلاقة ، وتخضع لتثبيت تحول الأس الهيدروجيني.
6. قم بتثبيت شرائط شبكية العين في 4٪ بارافورمالدهيد في 0.1 M PB عند درجة الحموضة 6.0 لمدة 20 - 30 دقيقة ثم في 4٪ بارافورمالدهيد بالإضافة إلى 0.01٪ جلوتارالديهايد عند درجة الحموضة 10.5 لمدة 10 - 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
7. بعد عدة غسلات في PB مع 0.15 ملي CaCl ₂ (درجة الحموضة 7.4 عند 4 درجات مئوية) ، قم بالتبريد بحماية شرائط الشبكية بالجلسرين (60 دقيقة لكل منها بنسبة 10٪ ، 20٪ ، 30٪ ، ثم بين عشية وضحاها [O / N] في 30٪) في 0.1 M PB قبل استبدال التجميد.

2. استبدال التجميد

ملاحظة: تم تعديل طريقة استبدال التجميد هذه من بروتوكول منشور سابقا. أيضا ، من الأهمية بمكان أن تكون الأدوات شديدة البرودة (ارتداء القفازات) ؛ خلاف ذلك ، قد تذوب الأنسجة جزئيا عند لمسها بالأدوات. تتم كل هذه الخطوات داخل غرفة الاستبدال التلقائي للتجميد (AFS) ولا يسمح أبدا للأدوات بالتحرك فوق حافة الغرفة. وبالمثل ، فإن التبريد المناسب لجميع المواد الكيميائية المستخدمة في AFS ضروري.

1. قم بتجميد شرائط الشبكية في البروبان السائل عند -184 درجة مئوية في أداة الحفظ بالتبريد بالمجهر الإلكتروني (EM). باستخدام فرشاة دقيقة ، ضع العينات على قطع صغيرة من الشريط اللاصق المزدوج المرفقة ببذرة معدنية موجودة في نهاية قضبان الغاطس (تخلص من المخزن المؤقت الإضافي باستخدام الفرشاة).
2. اغمر القضبان في البروبان السائل واحتفظ بها هناك لمدة 5 ثوان تقريبا ، ثم انقلها إلى أداة استبدال التجميد الأوتوماتيكية (AFS) باستخدام غرفة نقل صغيرة مملوءة بالنيتروجين السائل (LN ₂ حاوية نقل تبريد مبردة).
3. بعد وضع العينة والأدوات المجمدة (الملقط والمشرط) في AFS ، قم بتبريد الأدوات في الغرفة لعدة دقائق قبل لمس الأنسجة ، أو قم بتبريدها عن طريق وضع أطراف الأدوات لبضع ثوان في غرفة النقل الصغيرة (مملوءة بالنيتروجين السائل (LN ₂ حاوية نقل تبريد مبردة)).
4. بمجرد دخولك إلى AFS ، قم بإزالة العينة والشريط من كعب الروتين باستخدام مشرط ناعم. أيضا ، احتفظ بالتحكم في تدفق غاز النيتروجين ، TF (يوصف TF بأنه "تحكم منظم ل LN ₂ مبخر") مفتوحا أثناء هذه الإجراءات.
5. قبل وضع الأنسجة المجمدة في حوامل التضمين المسطحة ( أي ، قبل إعداد AFS) ، قم بقص دائرة رفيعة من لوح بلاستيكي شفاف وضعها في قاع الحامل لبطانة قاع كل بئر. هذا يسمح بإزالة أسهل نسبيا لكتل العينات المبلمرة عند الانتهاء.
   ملاحظة: في السابق ، استخدمنا طريقة بديلة لحاملات التضمين المسطحة ، واستخدمنا كبسولات Reichert + الجيلاتين المزدوجة.
6. استخدم التسلسل التلقائي التالي في AFS (باستخدام مصطلحات الأداة): T1 = -90 درجة مئوية لمدة 32 ساعة ، S1 = زيادة درجة الحرارة بمقدار 4 درجات مئوية / ساعة (11.3 ساعة) ، T2 = -45 درجة مئوية لمدة 50 ساعة ، S2 = زيادة درجة الحرارة بمقدار 5 درجات مئوية / ساعة (9 ساعات) ، T3 = 0 درجة مئوية لمدة 40 ساعة (الإجمالي = 142.3 ساعة). قد يستغرق وضع العينات في AFS (عند -90 درجة مئوية) من 2 إلى 4 ساعات قبل بدء التسلسل الموقوت.
7. اغمر الأجزاء المجمدة في 1.5٪ أسيتات اليورانيل في الميثانول عند -90 درجة مئوية لمدة >32 ساعة في AFS. ضع قطعتين من المناديل (عادة) في كل من الآبار السبعة في حامل الألمنيوم المسطح (ثلاثة تتناسب مع AFS).
   1. ضع الأنسجة + الشريط في أسيتات اليورانيل / الميثانول في الآبار وقم بإزالة الشريط لاحقا ، قبل البدء في تسلل وسط التضمين (مثل Lowicryl HM20) ، إذا كان من الصعب جدا إزالة الأنسجة من الشريط.
8. ثم قم بزيادة درجة الحرارة تدريجيا إلى -45 درجة مئوية (+ 4 درجة مئوية في الساعة ؛ بالتسلسل التلقائي).
9. اغسل العينات ثلاث مرات بالميثانول المبرد مسبقا، باستخدام ماصة بلاستيكية ذات رؤوس دقيقة لإزالة المحلول القديم من كل حامل تضمين مسطح، ثم استخدام ماصة بلاستيكية قياسية أخرى لإضافة الميثانول الطازج المبرد مسبقا.
10. بعد ذلك ، باستخدام نفس الطريقة ، تسلل العينات تدريجيا باستخدام راتنجات التضمين ذات درجة الحرارة المنخفضة مثل وسط التضمين (HM20 / الميثانول عند 1: 1 و 2: 1 ، كل منهما لمدة ساعتين ، متبوعا بالراتنج النقي لمدة ساعتين ثم قم بتغيير الراتنجات واحتفظ ب O / N).
11. قم بتغيير الراتنج مرة أخرى في اليوم التالي ، واضبط مستوى الراتنج للوصول إلى الحافة العلوية للآبار.
12. بلمرة العينات (-45 درجة مئوية إلى 0 درجة مئوية في التسلسل التلقائي ؛ + 5 درجات مئوية في الساعة) مع الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 40 ساعة.
13. ثم قم بإزالة العينات من AFS. عادة ما لا تزال كتل العينة تظهر بعض اللون الوردي في اللون. ضع العينات بالقرب من ضوء الفلورسنت في غطاء الدخان الكيميائي ، عند RT O / N أو أطول حتى تظهر واضحة تماما.

3. الكيمياء المناعية EM Immunogold

1. قطع أقسام 1 ميكرومتر باستخدام الميكروتوم الفائق ، وأقسام البقع مع 1٪ تولويدين الأزرق ، وفحصها لاتجاه القسم ؛ قم بتوجيه كتلة الأنسجة لتحقيق المستوى المستعرض الأمثل للتقسيم.
2. قم بقص أقسام فائقة النحافة بسمك 70 نانومتر باستخدام فائق الميكروتوم وجمعها على شبكات فتحات النيكل المطلية بالكربون من فورمفار.
3. اغسل الشبكات مرة واحدة في غسل H₂O مقطر متبوعا بمحلول ملحي مخزن ثلاثي ثلاث مرات (TBS ، 0.05 M Tris buffer ، 0.7٪ كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.6).
4. احتضان الشبكات في 20 ميكرولتر قطرات من 5٪ ألبومين مصل الأبقار (BSA) في TBS لمدة 30 دقيقة ، ثم في 20 ميكرولتر قطرات من خليط يحتوي على الوحدة الفرعية B لتوكسين الماعز المضاد للكوليرا (مضاد ل CTB ، 1: 3،000) وجسم مضاد لوحدة فرعية لمستقبلات N-methyl-D-aspartate (NMDAR) (الوحدة الفرعية NMDAR المضادة للأرانب الجلوتاماتيرجيك A [GluN2A] 1:50 ، GluN2B 1:30) ، أو GluA2 / 3 المضادة للأرانب (مستقبلات حمض α-أمينو-3-هيدروكسي-5-ميثيل-4-إيزوكسازولبروبيونيك [AMPA] ، 1:30) في TBS-Triton (TBST ، 0.01٪ Triton X-100 ، درجة الحموضة 7.6) مع 2٪ BSA و 0.02 M NaN_{} 3} O / N at RT.
5. اغسل الشبكات على ثلاث قطرات منفصلة (20 ميكرولتر) من TBS (درجة الحموضة 7.6) لمدة 10 و 10 و 20 دقيقة ، متبوعة ب TBS (درجة الحموضة 8.2) لمدة 5 دقائق.
6. احتضان الشبكات لمدة ساعتين قطرات (20 ميكرولتر) من خليط يحتوي على الغلوبولين المناعي المضاد للأرانب G (IgG ، 1:20) مقترنة بجزيئات الذهب 10 نانومتر والحمير المضادة للماعز IgG (1:20) مقترنة بجزيئات ذهب 18 نانومتر في TBST (درجة الحموضة 8.2) مع 2٪ BSA و 0.02 M NaN ₃ .
7. اغسل الشبكات في 20 ميكرولتر قطرات من TBS (درجة الحموضة 7.6) لمدة 5 و 5 و 10 دقائق ، ثم في ماء فائق النقاء ثم جففها.
8. شبكات مضادة للبقع تحتوي على 5٪ أسيتات اليورانيل و 0.3٪ سترات الرصاص في H المقطر ₂ O لمدة 8 و 5 دقائق في ظل الظروف المظلمة ، على التوالي.

المواد

<فئة الشكل = نمط الجدول = 'العرض: 703pt ؛ '>< فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ParaformaldehydeEMS15710 GlutarldehydeEMS16019 NaH₂PO4SigmaS9638 Na₂HPO4Sigma7782-85-6 CaCl₂SigmaC-8106 BSASigmaA-7030 Triton X-100SigmaT-8787 < td style = 'الارتفاع: 14.5pt ؛ '>NaOHSigma221465 < td style = 'الارتفاع: 16.5pt ؛ '>NaN₃JT BakerV015-05 GlycerolGibco BRL15514-011 Lowicryl HM 20Polysciences15924-1 Tris-BaseفيشرBP151-500 تريسفيشر04997-100 Anti-GluN2AMilliporeAB1555Pالتخفيف 1/50 < td style = 'الارتفاع: 14.5pt ؛ '>Anti-GluN2BMilliporeAB1557Pالتخفيف 1/30Anti-GluA2 / 3MilliporeAB1506التخفيف 1/30Anti-PSD-95MilliporeMA1–046التخفيف 1/100الحمار المضاد للأرانب IgG-10 نانومتر جزيئات الذهبEMS25704التخفيف 1/20الحمار المضاد للفأر IgG-10 نانومتر جزيئات الذهبEMS25814التخفيف 1/20الحمار المضاد للفأر IgG-5 نانومتر جزيئات الذهبEMS25812التخفيف 1/20 الحمار المضاد للماعز IgG-18 نانومتر جزيئات الذهبJackson ImmunoResearch705-215-147التخفيف 1/20 شبكات فتحات النيكل المطلية بالكربون Formvar.EMSFCF2010-Ni Uranyl acetateEMS22400-1 MethanolEMS67-56-1 Lead citrateLeica Leica EM AFSLeica Leica EM CPCLeica UltromicrotomeLeica JEOL 1200 EMJEOL النيتروجين السائل روبرتس الأكسجين Propaneروبرتس أكسجين CTBList Biological Laboratories1041-1.2٪Anti-CTBList BiologicalLaboratories 703Dilution 1/4000