المراقبة في الوقت الحقيقي لتنشيط مستقبلات الرائحة في الخلايا المؤتلفة

الملخص

المصدر: de March, C. A. et. al., المراقبة في الوقت الفعلي في المختبر لتنشيط مستقبلات الرائحة بواسطة رائحة في مرحلة البخار. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو طريقة مراقبة التنشيط في الوقت الفعلي لمستقبلات الرائحة في خلايا الثدييات المؤتلفة باستخدام قياس اللمعان. يؤدي ارتباط الرائحة إلى تنشيط بروتين G وإنتاج cAMP ، مما يؤدي إلى تنشيط بروتينات glosensor التي تنبعث منها تلألؤ عند ربط الركيزة ، مما يوفر مقياسا كميا لاستجابة المستقبلات.

البروتوكول

1. Hana3A Cells Culture

1. إعداد M10 (الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) بالإضافة إلى 10٪ v / v مصل الأبقار الجنيني (FBS)) و M10PSF (M10 بالإضافة إلى 100 ميكروغرام / مل البنسلين الستربتومايسين و 1.25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B).
2. culture الخلايا في 10 مل من M10PSF في طبق زراعة خلية 100 مم في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO2).
3. قسم الخلايا كل يومين بنسبة 20٪: عندما يلاحظ التقاء الخلايا بنسبة 100٪ (حوالي 1.1 × 10⁷ خلايا) تحت مجهر تباين الطور ، استطاهر الوسائط واغسل الخلايا برفق باستخدام 10 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS).
4. شفط PBS وإضافة 3 مل من 0.05٪ حمض رباعي أسيتيك تريبسين-إيثيلين ديامين (EDTA، 0.48 ملليمتر). دعه يعمل لمدة 1 دقيقة تقريبا ، حتى تنفصل الخلايا عن اللوحة.
5. أضف 5 مل من M10 لتعطيل التربسين وفي النهاية فصل الخلايا التي لا تزال متصلة باللوحة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
6. انقل الحجم (8 مل) إلى أنبوب سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. تجنب تكوين فقاعات في الأنبوب.
7. انقل 1 مل من محلول الخلايا المعلقة في طبق ثقافة خلية جديد مقاس 100 مم وأضف 9 مل من M10PSF الطازج. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.

2. تحضير الخلايا للتعداد

1. تقييم التقاء، أو عدد الخلايا، من خلال مراقبتها تحت مجهر تباين الطور. هناك حاجة إلى التقاء 10٪ على الأقل (حوالي 1.1 × 10⁶ خلايا) للوحة واحدة.
2. استنشق الوسائط واغسل الخلايا برفق باستخدام 10 مل من PBS. شفط PBS وأضف 3 مل من EDTA. دعه يعمل لمدة 1 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة ، حتى تنفصل الخلايا عن اللوحة.
3. أضف 5 مل من M10 لتعطيل التربسين وفي النهاية افصل الخلايا التي لا تزال متصلة باللوحة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. انقل الحجم (8 مل) إلى أنبوب سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
4. شفط المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا إلى 5 مل من M10PSF عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل لكسر أي كتلة خلية. تجنب تكوين فقاعات في الأنبوب.
5. اعتمادا على عدد اللوحات المراد نقلها، انقل كمية مناسبة من الخلايا في خزان بالحجم المقابل المناسب ل M10PSF. يجب طلاء صفيحة واحدة مكونة من 96 بئرا ب 1/10 من طبق ملتقى 100٪ 100 مم (حوالي 1.1 × 10⁶ خلايا) مخفف في M10PSF للوصول إلى الحجم الإجمالي 6 مل. بالنسبة للوحة واحدة مكونة من 96 بئرا تبدأ بطبق 100 مم ملتقى بنسبة 100٪ ، أضف 500 ميكرولتر من 5 مل من الخلايا المعلقة إلى 5.5 مل من M10PSF الطازج. امزج الخلايا و M10PSF دون توليد فقاعات هواء.
6. pipette 50 μL من الخلايا العالقة في كل بئر من اللوحة المكونة من 96 بئرا باستخدام ماصة متعددة القنوات. احتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.

3. Transfection

1. راقب اللوحة المكونة من 96 بئرا تحت مجهر تباين الطور لضمان التقاء الخلية بين 30٪ و 50٪.
2. قم بإعداد أول مزيج تعداء يحتوي على البلازميدات الشائعة في اللوحة بأكملها (نسخة أقصر من البروتين الناقل للمستقبلات 1 (RTP1S) ومستقبلات الرائحة (OR) وبروتين Glosensor؛ انظر جدول المواد) باتباع الأحجام الواردة في الجدول 1. لاحظ أنه يجب قسمة كمية OR الموسومة على Rho على عدد ORs إذا كانت عدة ORs.
   NOTE: ننصح بشدة بإضافة عنصر تحكم سلبي فارغ (هنا Rho-pCI) وأي تحكم إيجابي (أو معروف بالاستجابة للرائحة المختبرة) إلى خطة التجربة.
3. قم بإعداد مزيج تعداء ثان يحتوي على 500 ميكرولتر من MEM و 20 ميكرولتر من كاشف Lipofectamine 2000 (صالح للوحة واحدة ذات 96 بئرا ، انظر جدول المواد). أضف المزيج الثاني إلى المزيج الأول ، واخلطه برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل واحتضانه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف 5 مل من M10 واخلطه برفق.
4. استبدل M10PSF في اللوحة المطلية مسبقا بسعة 96 بئرا بمقدار 50 ميكرولتر من وسائط التعداء النهائية. احتضن في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ وقم بتفريغ حجرة مقياس الإضاءة طوال الليل.

4. حضانة الركيزة

1. راقب اللوحة المكونة من 96 بئرا تحت مجهر تباين الطور لضمان التقاء الخلية بين 60٪ و 100٪. تحضير محلول محاكاة لمحلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) يحتوي على 10 ملي مولار من حمض هيدروكسي إيثيل بيبرازين إيثان سلفونيك (HEPES) و 5 ملي مولار من د-جلوكوز.
2. خفف 75 ميكرولتر من محلول كاشف الأدينوزين أحادي الفوسفات الدوري (cAMP) إلى 2.75 مل من محلول التحفيز. قم بإزالة وسط التعداء من اللوحة المكونة من 96 بئرا واغسل الخلايا بإضافة 50 ميكرولتر من محلول التحفيز الجديد إلى كل بئر.
3. قم بإزالة محلول التحفيز وأضف 25 ميكرولتر من محلول كاشف cAMP المحضر في الخطوة 4.2 إلى كل بئر. احتضن اللوحة المكونة من 96 بئرا في درجة حرارة الغرفة في بيئة مظلمة وخالية من الروائح (على سبيل المثال ، درج فارغ نظيف بعيدا عن المواد الكيميائية أو أي مصدر رائحة) لمدة ساعتين.

5. Odorant Stimulation

1. first, equinition chamber of luminometer עם جزيئات الرائحة المتطايرة. خفف الرائحة إلى التركيز المطلوب في 10 مل من الزيت المعدني (الشكل 1 أ). قبل نهاية وقت حضانة كاشف cAMP ، أضف 25 ميكرولتر من محلول الرائحة إلى صفيحة جديدة مكونة من 96 بئرا (وليس تلك التي تحتوي على الخلايا). احتضن لوحة الرائحة هذه في درجة حرارة الغرفة في غرفة مقياس الإضاءة لمدة 5 دقائق (الشكل 1 ب) (لا يلزم تسجيل مقياس الإضاءة هنا).
2. اضبط مقياس الإضاءة لتسجيل التلألؤ مع 0 ثانية من التأخير خلال 20 دورة من قياس اللوحة لمدة 90 ثانية مع 0.7 ثانية من الفاصل الزمني بين الدورات.
3. مباشرة قبل قراءة اللوحة مباشرة، قم بإزالة لوحة الرائحة من الغرفة. أضف 25 ميكرولتر من الرائحة بين آبار الصفيحة المكونة من 96 بئرا التي تحتوي على الخلايا (لا تضيف الرائحة في الآبار التي تحتوي على الخلايا) وابدأ بسرعة في قياس التلألؤ لجميع الآبار لمدة 20 دورة في غضون 30 دقيقة (الشكل 1 ج).

الجدول 1: امزج للتعداد. كميات من البلازميدات (بروتين Glosensor و RTP1S و OR) لإضافتها إلى MEM لنقلها إلى لوحة واحدة مكونة من 96 بئرا.

<فئة الشكل = نمط "الجدول" = "تعويم: اليسار ؛" ><فئة الجدول = 'ck-table-resize" النمط = ';>< نمط عمود = 'العرض: 50٪ ؛ '> < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحدود: 0.625pt #1a202c صلبة ؛ الحشوة: 4 نقطة 2pt ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ border: 0.625pt صلبة #1a202c ؛ الحشوة: 4pt 2pt ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>

MEM

500 μL

pGlosensor

10 ng

RTP1S

5 ng

< td style='background-color:#ffffff;border:0.625pt solid #1a202c;padding:4pt 2pt;vertical-align:top;'>

OR

75 ng

 

النتائج

الشكل 1: بروتوكولات تخطيطية للمراقبة في الوقت الفعلي لتنشيط مستقبلات الرائحة بواسطة الرائحة المتبخرة. تم تخفيف الرائحة (البنفسجية) بالتركيز المطلوب في الزيت المعدني (A). ثم تم طل...

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول' >< فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = ';'> < col style = 'العرض: 25٪ ؛ '>< col style = 'width: 25٪ ؛ '>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td style = 'background-color: #ffffff ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: top ؛ '>0.05٪ trypsin-EDTA < td style = 'background-color: #ffffff ؛ padding: 0px 3px ؛ text-align: center ؛ vertical-align: top ؛ '>Gibco25300-0540.05٪ Trypsin - EDTA (1x), phenol red - تخزين عند 4 °C100 mm cell cell culture styleBD Falcon< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>353003 < نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> 100 مم × 20 مم طبق ثقافة الخلية < نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> 15 مل أنبوب < نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>BD Falcon< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص : المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>352099 < نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> 17 مم × 120 مم الأنابيب المخروطية < نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ لوحة > 96 جيدا < نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> كورنينج< td style = 'background-color: #ffffff ؛ padding: 0px 3px ؛ text-align: center ؛ vertical-align: top ؛ '> 3843 < td style = 'background-color: #ffffff ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: top ؛ '> 96 جيدا ، مع غطاء LE أبيض مع قاع شفاف بولي دي ليسين مطلي بالبوليسترين < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>Amphotericin < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> جيبكو15290-018Amphotericin B 250 ميكروغرام/مل - تخزين في 4 °Cآلة الطرد المركزيجوان< td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;text-align:center;vertical-align:top;'>C312 آلة الطرد المركزي مع دوار دلو متأرجح ل 15 مل<td style='لون الخلفية:#ffffff;الحشوة:0px 3px;vertical-align:top;'> الفئة الثانية نوع A / B3 الدخان NUAIRE< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> NU-407-500 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> الدخان لزراعة الخلايا < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>FBS< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>Gibco < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص:center; المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ ' >16000-044Fetal Bovine Serum - تخزين عند -20 °CGloSensor cAMP ReagentPromegaE1290< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> GloSensor cAMP كاشف الركيزة البروتين المضيئة - تخزينها عند -20 درجة مئوية< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> الحاضنة 37 درجة مئوية ؛ 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون < نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> فيشر العلمي < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> 11-676-604 < نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> حاضنة لزراعة الخلايا< td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Lipofectamine 2000 reagentInvitrogen11668-019Lipofectamine 2000 Reagent 1mg / ml transfection - تخزين عند 4 درجات CLuminometer POLARstar OPTIMABMG LABTECHdisstop96 Well plate reader for luminescence< td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Mineral OilSigmaM8410مذيب للروائح - يخزن في درجة حرارة الغرفةالحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> Corning cellgro < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> 10-010-CV < نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسي مع أملاح إيرل & L-الجلوتامين - يخزن في 4 درجات مئوية< td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Penicillin / StreptomycinSigma AldrichP4333استقر محلول البنسلين والستربتومايسين ب 10,000 وحدة من البنسلين و 10 ملغ من الستربتومايسين - يخزن عند -20 درجة مئوية < نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> pGlosensor < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> Promega < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>E2301 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff; الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ ' >pGloSensor-22F cAMP بلازميد البروتين المضيء - يخزن في 4 درجات مئوية < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> مجهر تباين المرحلة < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>Leica < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>090-131.001 < نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ ' >مجهر تباين الطور مع أهداف x4 ، x10 ، x20 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>RTP1S< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>H. Matsunami lab < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>-< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> 100 نانوغرام / ميكرولتر بلازميد - يخزن في 4 درجات مئوية