المراقبة في الوقت الحقيقي لتنشيط مستقبلات الرائحة في الخلايا المؤتلفة

الملخص

المصدر: de March, C. A. et. al., المراقبة في الوقت الفعلي في المختبر لتنشيط مستقبلات الرائحة بواسطة رائحة في مرحلة البخار. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو طريقة مراقبة التنشيط في الوقت الفعلي لمستقبلات الرائحة في خلايا الثدييات المؤتلفة باستخدام قياس اللمعان. يؤدي ارتباط الرائحة إلى تنشيط بروتين G وإنتاج cAMP ، مما يؤدي إلى تنشيط بروتينات glosensor التي تنبعث منها تلألؤ عند ربط الركيزة ، مما يوفر مقياسا كميا لاستجابة المستقبلات.

البروتوكول

1. Hana3A Cells Culture

1. إعداد M10 (الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) بالإضافة إلى 10٪ v / v مصل الأبقار الجنيني (FBS)) و M10PSF (M10 بالإضافة إلى 100 ميكروغرام / مل البنسلين الستربتومايسين و 1.25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B).
2. culture الخلايا في 10 مل من M10PSF في طبق زراعة خلية 100 مم في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO2).
3. قسم الخلايا كل يومين بنسبة 20....

النتائج

الشكل 1: بروتوكولات تخطيطية للمراقبة في الوقت الفعلي لتنشيط مستقبلات الرائحة بواسطة الرائحة المتبخرة. تم تخفيف الرائحة (البنفسجية) بالتركيز المطلوب في الزيت المعدني (A). ثم تم طل.......

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول' >< فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = ';'> < col style = 'العرض: 25٪ ؛ '>< col style = 'width: 25٪ ؛ '>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td style = 'background-color: #ffffff ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: top ؛ '>0.05٪ trypsin-EDTA < td style = 'background-color: #ffffff ؛ padding: 0px 3px ؛ text-align: center ؛ vertical-align: top ؛ '>Gibco25300-0540.05٪ Trypsin - EDTA (1x), phenol red - تخزين عند 4 °C100 mm cell cell culture styleBD Falcon< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>353003 < نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> 100 مم × 20 مم طبق ثقافة الخلية < نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> 15 مل أنبوب < نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>BD Falcon< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص : المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>352099 < نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> 17 مم × 120 مم الأنابيب المخروطية < نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ لوحة > 96 جيدا < نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> كورنينج< td style = 'background-color: #ffffff ؛ padding: 0px 3px ؛ text-align: center ؛ vertical-align: top ؛ '> 3843 < td style = 'background-color: #ffffff ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: top ؛ '> 96 جيدا ، مع غطاء LE أبيض مع قاع شفاف بولي دي ليسين مطلي بالبوليسترين < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>Amphotericin < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> جيبكو15290-018Amphotericin B 250 ميكروغرام/مل - تخزين في 4 °Cآلة الطرد المركزيجوان< td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;text-align:center;vertical-align:top;'>C312 آلة الطرد المركزي مع دوار دلو متأرجح ل 15 مل<td style='لون الخلفية:#ffffff;الحشوة:0px 3px;vertical-align:top;'> الفئة الثانية نوع A / B3 الدخان NUAIRE< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> NU-407-500 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> الدخان لزراعة الخلايا < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>FBS< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>Gibco < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص:center; المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ ' >16000-044Fetal Bovine Serum - تخزين عند -20 °CGloSensor cAMP ReagentPromegaE1290< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> GloSensor cAMP كاشف الركيزة البروتين المضيئة - تخزينها عند -20 درجة مئوية< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> الحاضنة 37 درجة مئوية ؛ 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون < نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> فيشر العلمي < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> 11-676-604 < نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> حاضنة لزراعة الخلايا< td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Lipofectamine 2000 reagentInvitrogen11668-019Lipofectamine 2000 Reagent 1mg / ml transfection - تخزين عند 4 درجات CLuminometer POLARstar OPTIMABMG LABTECHdisstop96 Well plate reader for luminescence< td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Mineral OilSigmaM8410مذيب للروائح - يخزن في درجة حرارة الغرفةالحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> Corning cellgro < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> 10-010-CV < نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسي مع أملاح إيرل & L-الجلوتامين - يخزن في 4 درجات مئوية< td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Penicillin / StreptomycinSigma AldrichP4333استقر محلول البنسلين والستربتومايسين ب 10,000 وحدة من البنسلين و 10 ملغ من الستربتومايسين - يخزن عند -20 درجة مئوية < نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> pGlosensor < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> Promega < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>E2301 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff; الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ ' >pGloSensor-22F cAMP بلازميد البروتين المضيء - يخزن في 4 درجات مئوية < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> مجهر تباين المرحلة < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>Leica < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>090-131.001 < نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ ' >مجهر تباين الطور مع أهداف x4 ، x10 ، x20 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>RTP1S< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>H. Matsunami lab < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '>-< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> 100 نانوغرام / ميكرولتر بلازميد - يخزن في 4 درجات مئوية