مقالة منهجية

إحداث تكوين جلطة دموية في دماغ الفأر باستخدام صبغة حساسة للضوء

أبريل 28, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Talley Watts، L.، et al. التخثر الضوئي في روز البنغال عن طريق التصوير البصري متحد البؤر في الجسم الحي: نموذج لسكتة دماغية أحادية السفينة. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو تقنية للحث على تكوين جلطة دموية في دماغ الفأر. يخضع الفأر المخدر مع نافذة الجمجمة والجمجمة الرقيقة للتخثر الضوئي من خلال تنشيط صبغة حساسة للضوء باستخدام ضوء عالي الكثافة. تولد هذه العملية أنواع الأكسجين التفاعلية ، والتي تلحق الضرر بجدران الأوعية الدموية وتؤدي إلى تكوين جلطة ، مما يؤدي في النهاية إلى إعاقة تدفق الدم إلى الدماغ.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. التخدير لتحضير القشرة

  1. ضع الفأر في غرفة تحريض مع 2-3٪ متزوفلوران ممزوج بالأكسجين للحث على التخدير. لاحظ انخفاض معدل التنفس مع تحفيز الفأر. اضغط على مخلب الفأر لتحديد ما إذا كان الفأر جاهزا للانتقال إلى مخروط الأنف. ملاحظة: مستوى التخدير هو خطوة حاسمة في أي في الجسم الحي يجب توخي الحذر حتى لا يسبب مستوى من شأنه أن يسبب نقص التروية الشامل.
  2. بمجرد تخدير الفأر بشكل كاف ، انقل إلى منصة الجراحة / التصوير وضع أنف الفأر في مخروط الأنف وقم بتطبيق 1-1.2٪ متزوفلوران للحفاظ على حالة التخدير. تأكد من أن الماوس مستلقي على وسادة تسخين يتم التحكم في درجة حرارتها للحفاظ على درجة حرارة الجسم (37 درجة مئوية +/- 0.5 درجة مئوية) طوال الإجراءات المتبقية. ضع مرهم الطبيب البيطري على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
  3. راقب فسيولوجيا الفأر باستخدام نظام قياس التأكسج النبضي باستخدام مشبك الذيل أو القدم المرفق مع النظام. تأكد من الحفاظ على معدل التنفس بين 50-65 نفسا / دقيقة. تأكد من أن معدل ضربات القلب يظل بين 300 إلى 450 نبضة في الدقيقة وأن يتم الحفاظ على تشبع الأكسجين بين 97-98٪ لضمان بقاء على المدى الطويل.
  4. عندما يتم تخدير الفأر بشكل كاف ، احلق الشعر فوق الجمجمة باستخدام المقص الكهربائي ، وقم بإزالة الشعر المتبقي وتنظيفه باستخدام البيتادين ، متبوعا بقطعة من الإيثانول. كرر هذا الإجراء حتى ثلاث مرات لضمان بيئة جراحية معقمة.

2. الإجراء الجراحي

  1. مع تنظيف فروة الرأس وحلقها بالكامل ، قم بعمل شق 5 مم في فروة رأس الفأر للكشف عن الشقوق القحفية وتحديد موقع الشقوق.
  2. استخدم قضيب قطني معقم لإزالة أي لفافة متبقية تغطي الجمجمة.
  3. قم بلصق حلقة مصنوعة خصيصا من الفولاذ المقاوم للصدأ ( الشكل 1 ) مع لاصق الأنسجة على العظم الذي يغطي القشرة الجدارية باستخدام الإحداثيات التجسيمية ل Bregma: -1 إلى -3 مم والجانبي: 2-4 مم. ملاحظة: عادة ما يتم تثبيت الغراء في غضون دقيقتين بعد وضع الحلقة على العظم.
  4. ألصق الحلقة على حامل تجسيمي ( الشكل 2 ) لتثبيت الماوس ومنع الحركة أثناء التصوير.
  5. تحت مجهر تشريح من الدرجة الجراحية ، قم بحفر قسم 1-2 مم ببطء في الجمجمة باستخدام أداة تشبه الدرميل يتم التحكم فيها بسرعة (مثقاب Meisinger 3.9 مم) مع التأكد من الحفاظ على مستوى المنطقة أثناء الحفر. حقق ذلك باستخدام نمط متعرج. لتجنب تراكم الحرارة ، اضبط سرعة الحفر على مستوى منخفض وخذ فترات راحة متكررة.
  6. عندما تصبح الجمجمة الجمجمة لامعة في المظهر ، استمر في ترقق الجمجمة باستخدام شفرة مشرط باستخدام نفس النمط المتعرج للحفاظ على مستوى السطح الرقيق لتسهيل الإزالة السلسة للطبقات الرقيقة من الجمجمة القحفية. باستخدام طرف شفرة المشرط ، قم بعمل ضربات خطية صغيرة بضغط خفيف لإزالة طبقات رقيقة من العظام في وقت واحد. استمر حتى تظهر الأوعية الدموية بوضوح من خلال مجهر التشريح.
  7. إذا قام المجرب بثقب الجمجمة أو كسرها أثناء عملية التخفيف ، فقم بالقتل الرحيم للحيوان بسبب التلف المحتمل للقشرة الأساسية.
    ملاحظة: يبلغ سمك جمجمة الفأر حوالي 300 ميكرومتر وتتكون من طبقتين رفيعتين من العظام المضغوطة (واحدة خارجية وواحدة طبقة داخلية) وطبقة من العظام الإسفنجية محصورة بين طبقتين من العظام المضغوطة. تتم إزالة الطبقة الخارجية من العظم المضغوط ومعظم العظم الإسفنجي داخل منطقة الحفر 5 مم مما يؤدي إلى طبقة تقريبية تبلغ 50 ميكرومتر من العظام المضغوطة المتبقية (انظر الشكل 2 ب ). سيضمن تصور الأوعية الدموية أن الجمجمة الرقيقة النهائية السليمة يبلغ سمكها حوالي 50 ميكرومتر. لذلك لا تزال الجمجمة موجودة عند تخفيفها إلى هذا السماكة.

3. إعداد المجهر

  1. استخدم نظام مجهر مقلوب (أنظمة تقليدية أو متحدة البؤر أو ثنائية الفوتون) يحتوي على عاكس موضوعي. ملاحظة: من الممكن أيضا استخدام مجهر عمودي قياسي. سيكون العامل المحدد هو المسافة بين المرحلة والأهداف. قد تكون التعديلات على المرحلة ضرورية لإنجاز هذا الإعداد.
  2. قم بتأمين منصة الجراحة / التصوير في مرحلة مخصصة تقع بجانب قاعدة المجهر. ملاحظة: تم تصنيع المنصة باستخدام مقبس مختبر للسماح بالحركة الرأسية للمنصة الجراحية / التصوير تحت الهدف. يتم تثبيت مقبس المختبر على لوحة مثبتة على أربعة أعمدة أسطوانية. (انظر الشكل 2 ).
  3. ضع العاكس الموضوعي الذي يحتوي على هدف 20X فوق نافذة الجمجمة. استخدم مصدر ضوء خارجي للعثور على نافذة الجمجمة من خلال النظر من خلال عدسات المجهر ووضع الهدف في منطقة التصوير. ملاحظة: سيتم الإشارة إلى منطقة التصوير بوجود الأوعية الدموية.
  4. بالنسبة للأهداف القائمة على الماء ، استخدم السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF) (130 ملي كلوريد الصوديوم ؛ 30 ملي كلوريد الكنوديوم ؛ 12 ملي كيلو كلوريد (12 ملي كلوريد الصوديوم) 2 PO 4 ؛ 200 ملي مولار NaHCO 3 ؛ 30 ملي مولار هيدروكسي إيثيل بيبيرازين إيثان حمض السلفونيك [HEPES] ؛ و 100 ملي مولار جلوكوز) كوسيط بسبب التسرب المحتمل إلى تجويف الجمجمة أثناء التصوير ( الشكل 3 ).

4. تحضير صبغة روز البنغال وإدارتها وتحريضها للسكتة الدماغية

  1. تحضير محلول طازج 20 مجم / مل من روز البنغال في aCSF ؛ التصفية والتعقيم قبل الإعطاء. لا تقم بإعادة استخدام أو تخزين Rose Bengal بمجرد خلطها. اصنع حلا جديدا لكل تجربة.
  2. أعط حقنة وريد الذيل 0.1 مل من Rose Bengal أثناء مسح نافذة الجمجمة بليزر 561 نانومتر لضمان الحقن الكافي للمحلول. ملاحظة: سيتم تصور روز البنغال في غضون 5 ثوان بعد الحقن في الأوعية الدموية في الدماغ. يجب ملء السفينة بأكملها بروز البنغال.
  3. بعد الحقن الكافي لصبغة Rose Bengal ، اختر وعاءا مناسبا للتخثر بناء على قطر الوعاء (40-80 ميكرومتر) لضمان قابلية تكرار حجم آفة معين. التفريق بين الشرايين والأوردة من خلال النظر في اتجاه تدفق الدم: ستنتقل الشرايين من أوعية ذات قطر أكبر إلى أوعية ذات قطر أصغر ، وتنتقل الأوردة من أوعية ذات قطر أصغر إلى أكبر قطر. يتم تحقيق ذلك بسهولة عن طريق التصور بمجرد حقن روز البنغال.
  4. قم بتغيير إعداد المجهر على النحو التالي:
    1. زيادة وقت السكون. ملاحظة: سيختلف هذا اعتمادا على نظام المجهر المستخدم.
    2. زيادة قوة الليزر إلى 100٪.
    3. اجمع صور التسلسل الزمني بمعدل 1 إطار/ثانية باستخدام سرعة المسح القصوى.
  5. امسح الماوس ضوئيا حتى تتشكل جلطة مستقرة داخل الوعاء. ملاحظة: يتم تحقيق ذلك عادة في غضون 5 دقائق من المسح المستمر (انظر الشكل 4 ).
  6. بعد تحريض تكوين الجلطة باستخدام روز البنغال ، قم بإزالة الفأر من منطقة التصوير مرة أخرى إلى مجهر التشريح. قم بإزالة الحلقة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ بعناية من الجمجمة الجمجمة. افحص نافذة الجمجمة بحثا عن أي نزيف. في حالة حدوث نزيف ، قم بإنهاء التجربة.
  7. استخدم خياطة 6.0 أحادية الشعيرات لإغلاق الشق فوق الجمجمة. ضع مرهم المضادات الحيوية على طول خط الخياطة لمنع العدوى. حقن بوبرينكس (0.05 ملغم/كغ) تحت الجلد كل 12 ساعة لمدة ثلاثة أيام للتحكم في الألم.
  8. أعد الفأر إلى غرفة الاسترداد بعد إزالته من المخدر حتى يستيقظ تماما ويتحرك بحرية.
  9. أعد الماوس إلى قفص نظيف لمزيد من التحقيق في وقت لاحق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1

الشكل 1: حلقة من الفولاذ المقاوم للصدأ. تظهر ثلاث مناظر (مناظر علوية وجانبية وأسفلية) لحامل الحلقة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ الذي يتم تطبيقه على جمجمة الماوس لتثبيته على الحامل التجسيمي.

figure-results-2

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

< فئة الشكل = نمط الجدول: "العرض: 875pt ؛ '>< فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ReagentsRose BengalSigma330000 Isoflurane AnestheticMWI Veterinary Supply088-076 Vetbond1469SB1469SB aCSF 126 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.5 ملي كلوريد كلوريد الصوديوم ، 1.25 ملي هيدروشمير2PO4 ، 2 ملي ملي كلوريدالمغنيد 2 ، 2 ملي كلوريد الكالسيوم2 ، 10 ملي جلوكوز و 26 ملي مولار هيدروكسيد الصوديوم3 (الرقم الهيدروجيني 7.4). < td style = 'الارتفاع: 15.5pt ؛ ' colspan = '4'> المعدات < td style = 'الارتفاع: 15.5pt ؛ '> تشريح مقصالمنتجات الصناعية الحيوية500-410 مقص التشغيل 14 سمالمنتجات الصناعية الحيوية12-055 Fallps Dumont High Tech # 5 style ، منتجات صناعية حيوية مستقيمةTWZ-301.22 LabJack 132X80Optosigma Co123-6670 Platform for Labjack 8X 8Optosigma Co145-1110 حامل شريط الأذن من الإعداد التجسيميStoelting / Cyborg51654 Dispomed Labvent Rodent Analyst آلةDRE، Inc.15001 Tech IV Isoflurane مبخرDRE, Inc.34001 F Air CanisterDRE, Inc80120 Bain circuit breathing tubeDRE, Inc86111B محول القوارض لأنبوب حمامDRE، Inc891000 O2 منظم لخزانات الأكسجينDRE، IncCE001E غرفة تحريض القوارضDRE، Inc15004C Ethicon Silk 6-0; 18 بوصة مع خياطة إبرة P-3Express1639G العاكس الموضوعي محول بصري تقنيات LSM حفر فوردوم الجهد المزدوج 110/120فوردوم134.53

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة