تقييم سلامة الحاجز الدموي الدماغي في نموذج فئران إصابات الدماغ الناجم عن الليزر

الملخص

المصدر: Kuts, R. et al. إصابات الدماغ الناجمة عن الليزر في القشرة الحركية للفئران. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو تقييم سلامة الحاجز الدموي الدماغي (BBB) بعد إصابة الدماغ الناجمة بالليزر في الفئران. يتم حقن صبغة تتبع في وريد الذيل ، مما يسمح لها بالدوران إلى الدماغ والتسرب إلى الأنسجة من خلال BBB التالف. ثم يتم استخراج الدماغ ومعالجته لإطلاق الصبغة. يتم قياس شدة التألق للصبغة لتحديد مدى تلف BBB الناجم عن الليزر.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. الإجراء التجريبي لإصابات الدماغ الناجمة عن الليزر

1. قم بتعيين 20 فأرا لمجموعة تم تمييزها كمجموعة ليزر و 20 فأرا لمجموعة تحكم أخرى (تعمل بالدم).
2. أخضع فئران مجموعة الليزر للإشعاع بالليزر عند 50 J × 10 نقاط بالطريقة التالية:
   1. تخدير الفئران بمزيج من 2٪ من الأيزوفلوران في الأكسجين مما يسمح بالتهوية التلقائية. تحقق من عمق التخدير الكافي عن طريق الضغط على الذيل بالملقط لمعرفة عدم وجود منعكس الانسحاب.
   2. حافظ على درجة حرارة الجسم الأساسية للفئران عند 37 درجة مئوية طوال الإجراء التجريبي باستخدام وسادة تسخين منظمة بدرجة حرارة المستقيم.
   3. قم بإزالة الشعر المحلي باستخدام ماكينة الحلاقة وتطهيره باستخدام 70٪ كحول و 0.5٪ كلورهيكسيدين غلوكونات. كرر خطوة التطهير مرتين أخريين.
      ملاحظة: يجب أن يكون حجم الشق الجراحي حوالي 3 سم. قم بإزالة الشعر على الأقل 2 سم حول منطقة الشق.
   4. ضع الجرذ على حامل رأس تجسيمي في وضع الانبطاح وقم بعمل شق 3 سم ليعكس فروة الرأس بشكل جانبي ولفضح المنطقة الواقعة بين بريجما ولامدا.
   5. الحفاظ على التخدير من خلال مخروط الأنف.
   6. استخدم ليزر عقيق ألومنيوم الإيتريوم المخدر بالنيوديميوم (Nd-YAG) (ذروة الطول الموجي 1064 نانومتر) لإدارة 50 J × 10 نقطة ، مع مدة نبضة 1 ثانية ، إلى المنطقة المكشوفة من الجمجمة فوق نصف الكرة الأيمن.
   7. تأكد من أن جزء توليد الليزر من الجهاز على مسافة 2 مم من المنطقة المكشوفة لإنتاج شعاع ليزر. تم اختيار 50 J × 10 نقطة بعد تقييم دقيق لمجموعات الطاقة / السطح المختلفة. هذا المزيج فعال ولا يسبب تدمير العظام للجمجمة بعد تناوله لمدة تقل عن ثانية.
      ملاحظة: 2 مم هي المسافة بين طرف شعاع الليزر (من الكبل البصري الذي يتم تمريره من خلاله) وعظم الجمجمة. في حالة استخدام عدسة التركيز البؤري ، يجب حساب المسافة مع الأخذ في الاعتبار زاوية ميل العدسة لتركيز الشعاع في منطقة الضرر المطلوبة. تأكد من السلامة المناسبة عند استخدام جهاز الليزر بما في ذلك التدريب المناسب وحماية العين.
   8. أخرج الجرذ من الجهاز وأغلق فروة الرأس ب 3-0 خيوط جراحية حريرية.
   9. توقف عن التخدير وأعد الجرذ إلى قفصه للشفاء. يجب تطبيق 0.1 مل من 0.25٪ بوبيفاكائين محليا لتقليل الألم بعد الجراحة مباشرة بعد الجراحة.
      ملاحظة: يجب أن يستمر الإجراء بأكمله أقل من 5 دقائق إذا تم تنفيذه بشكل صحيح.
3. راقب الجرذ بحثا عن أي علامات للضيق أثناء التعافي بعد التخدير. قبل الخروج من التخدير ، أعط 0.01 مجم / كجم بوبرينورفين عضلي لتسكين الألم بعد الجراحة واستمر في الجرعات المتكررة كل 12 ساعة لمدة 48 ساعة على الأقل.
4. يتحكم في الفئران لنفس الظروف دون إخضاعها للليزر.

2. درجة الشدة العصبية (NSS)

1. تقييم درجة الشدة العصبية بعد 24 ساعة من إصابة الدماغ الناجمة عن الليزر باستخدام درجة 43 نقطة. اختبر بحثا عن العجز العصبي ، والاضطرابات السلوكية ، ومهمة موازنة الحزمة ، وردود الفعل ، وتعيين درجات أعلى للإعاقات الأكثر شدة.

3. تقييم إصابات الدماغ

1. تحديد مدى كسر الحاجز الدموي الدماغي (BBB)
   } ملاحظة: تقييم كسر BBB بعد 24 ساعة من إصابة الدماغ الناجمة عن الليزر على النحو التالي:
   1. إعطاء 2٪ إيفانز بلو ممزوج بمحلول ملحي 4 مل / كجم عن طريق الوريد للفئران عبر وريد الذيل المقنن والسماح للمحلول بالدوران لمدة 1 ساعة.
   2. } القتل الرحيم للفئران عن طريق تعريضها ل 20٪ أكسجين و 80٪ ثاني أكسيد الكربون ₂ (عن طريق الإلهام) بعد 24 ساعة من آخر NSS.
   3. احصد الصبغة الموضعية داخل الأوعية الدموية على النحو التالي:
      1. افتح صدور الفئران باستخدام الدبابيس الجراحية والمقص الجراحي.
      2. قم بتنقية بمحلول ملحي مبرد بنسبة 0.9٪ عبر البطين الأيسر باستخدام 110 مم زئبق حتى الحصول على سائل تروية عديم اللون من الأذين الأيمن.
   4. احصد الأدمغة وقم بتقطيعها إلى شرائح بحجم 2 مم.
   5. افصل شرائح الدماغ اليسرى عن الأجزاء اليمنى لتقييم نصفي الكرة الأرضية المصابين وغير المصابين بشكل منفصل.
   6. قم بوزن وتجانس باستخدام الملاط والمدقة ، ثم احتضان أنسجة المخ في 50٪ من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك لمدة 24 ساعة.
   7. الطرد المركزي شرائح الدماغ المتجانسة عند 10,000 × جم لمدة 20 دقيقة.
   8. امزج 1 مل من المادة الطافية من الدماغ بالطرد المركزي مع 1.5 مل من 96٪ من الإيثانول عند 1: 3 وقم بتقييم الحاجز الدموي الدموي الدماغي الكسر باستخدام كاشف مضان عند الطول الموجي للإثارة 620 نانومتر (عرض النطاق الترددي 10 نانومتر) والطول الموجي للانبعاث 680 نانومتر (عرض النطاق الترددي 10 نانومتر).
      ملاحظة: تخضع كلتا المجموعتين من الفئران لنفس البروتوكول لتحديد انهيار BBB.

المواد

<فئة الشكل = نمط الجدول: = 'العرض: 949pt ؛ '><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 50٪ trichloroacetic acidSIGMA - ALDRICH76-03-9 Brain & Tissue MatricesSIGMA - ALDRICH15013 Cannula Venflon 22 GKD-FIX1.84E + 11 الطرد المركزي Sigma 2-16PSIGMA - ALDRICHSigma 2-16P Compact AnalyticalBalances SIGMA - ALDRICHHR-AZ/HR-A Digital WeighingScale SIGMA - ALDRICH4,000 Rs تشريح مقصSIGMA - ALDRICHZ265969 ماصة EppendorfSIGMA - ALDRICHZ683884 Eppendorf TubeSIGMA - ALDRICHEP0030119460 Ethanol 96٪ROMICAL Flammable Liquidإيفانز بلو 2٪SIGMA - ALDRICH314-13-6 كاشف التألقTecan، Männedorf سويسرانموذج Infinite 200 PRO قارئ متعدد الأوضاع سخان مع ميزان حرارةHeatingpad-1الموديل: HEATINGPAD-1/2 Infusion CuffABNIC-500 Isofluran ، USP 100٪ Piramamal Critical Care، IncNDC 66794-017 MultisetTEVA MEDICAL998702 Olympus BX 40 مجهرأوليمبوس أطباق PetriSIGMA - ALDRICHP5606 شفرات مشرط 11SIGMA - ALDRICHS2771 Sharplan 3000 Nd:YAG (عقيق الألومنيوم الإيتريوم المخدر بالنيوديميوم) آلة الليزرLaser Industries Ltd حامل الرأس التجسيميKOPF900LS حقنة معقمة 2 ملبراون4606027V إبرة حقنة 27 جمبراون305620