توطين التألق لبروتينات الوصلة الضيقة وألياف الإجهاد في الخلايا البطانية

الملخص

المصدر: Alluri, H., et al. الحرمان من الأكسجين والجلوكوز وإعادة الأكسجين كنموذج لإصابة التروية في المختبر لدراسة الخلل الوظيفي في الحاجز الدموي الدماغي. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح الفيديو توطين الفلورسنت لبروتينات التوصيل الضيقة وألياف الإجهاد في الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في دماغ الفئران (RBMECs). في الطبقة الأحادية المجهدة ، يتم استخدام الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية لتمييز بروتينات التوصيل الضيقة ، بينما يقوم الفالودين الموسوم بالفلوروفور بتسمية ألياف الإجهاد. ثم يتم تصور الجزيئات المسماة من خلال الفحص المجهري متحد البؤر.

البروتوكول

1. بذر الخلايا البطانية

< نمط ol = 'هامش أسفل: 0 ؛ الهامش الأعلى: 0 ؛ الحشو المضمنة البدء: 48 بكسل ؛ >

NOTE: ²NOTE:2. الحرمان من الأكسجين والجلوكوز - إعادة الأكسجين (OGD-R) in vitro model

1. استخدم نظام زراعة الخلايا نقص الأكسجة لدراسة تأثيرات OGD-R على RBMECs في (انظر الشكل 1). قم بإعداد ومعايرة نظام زراعة خلايا نقص الأكسجة قبل بدء التجربة ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. ₂ and 5٪ CO₂ لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية، لتمثيل حالة OGD.
3. ₂₂NOTE: هذه الخطوة يمثل حالة إعادة الأكسجين.
4. 3. Immunofluorescence توطين zonula occludens-1 (ZO-1) والأكتين الخيطي (f-actin) وضع العلامات باستخدام Rhodamine phalloidin
   1. كشف شرائح الغرفة التي تحتوي على طبقات أحادية RBMEC إلى 100 ميكرولتر من opti-MEM / وسائط مصل مخفضة / بئر لمدة 1 ساعة. اغسل شرائح الغرفة 3 مرات في 100 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.0-7.2). style='لون الخلفية:شفاف;اللون:#00000;عائلة الخط:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='1'>f-actin. style='هامش أسفل:0;margin-top:0;padding-inline-start:48px;'>
   2. لتلطيخ التألق المناعي ، احتضن الخلايا بجسم مضاد أولي مضاد للأرانب ضد ZO-1 في 1: 150 ، محضر في 2٪ BSA-PBS طوال الليل (O / N) عند 4 درجات مئوية. اغسل الخلايا 3 مرات في PBS (درجة الحموضة 7.0-7.2). احتضان ب 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب الموسومة بالفلورسينات (FITC) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT).

المواد

< فئة الشكل = نمط "الجدول" = 'العرض: 682 نقطة ؛ '><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>< col style = 'العرض: 20.09٪ ؛ '>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Proox model 110BiospherixModel 110 DMEM ، بدون جلوكوزGibco ، Life technologies11966-025 < td style = 'الارتفاع: 14.5pt ؛ '> Rhodamine PhalloidinLife technologiesR415 ZO-1 Rabbit Polyclonal AntibodyLife Technologies617300 Nunc Lab Tek II-CC 8 معقمة جيدا ، شرائح زجاجية 177402 علمية حرارية < td style = 'height: 14.5pt ؛ '> FITC الموسومة الثانوية المضادة للأرانب الجسم المضاد سانتا كروزSC-2090 DPBS 1XThermo scientificSH 30028.03يمكن استخدام أي برنامج تلفزيوني آخر متاح