إجراء الكيمياء المناعية على أنسجة دماغ الرئيسيات غير البشرية

الملخص

المصدر: Eid، L. & Parent، M. تحضير أنسجة دماغ الرئيسيات غير البشرية للكيمياء المناعية والفحص المجهري الإلكتروني. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو تحضير أنسجة دماغ الرئيسيات غير البشرية المثبتة بالألدهيد باستخدام الكيمياء المناعية المضمنة مسبقا للفحص المجهري الإلكتروني. يحدد خطوات وضع العلامات المناعية على بروتين عصبي معين ، متبوعا بتفاعل بيروكسيداز ينتج راسب ملونا ، مما يتيح تصور البروتين المستهدف في المجهر الإلكتروني.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. الكيمياء المناعية المسبق التضمين (الشكل 1C)

1. قم بإعداد محلول مخزون سعة 4 لتر من محلول ملحي مخزن ل Tris (TBS ، 50 ملي مولار ، درجة الحموضة 7.6) على النحو التالي.
   1. قم بقياس 2 لتر من الماء المقطر في دورق سعة 4 لتر ، أضف 24.23 جم من ثلاثي هيدروكسي ميثيل أمينوميثان (THAM; C₄H₁₁NO₃) ، ويقلب حتى يذوب.
   2. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.6 مع حوالي 148 مل من 1 نيوتن حمض الهيدروكلوريد. يجب إضافة الحمض بحذر لتجنب الوصول إلى درجة حموضة أقل من 7.6. يجب أن يكون الحجم الإجمالي 4 لتر.
      تحذير: حمض الهيدروكلوريك شديد التآكل. ارتد معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
2. حدد الأقسام التي تحتوي على منطقة الاهتمام المراد معالجتها للكيمياء المناعية EM.
3. اغسل الأقسام العائمة بحرية 3x في PBS (0.1 M ، درجة الحموضة 7.4) لمدة 5 دقائق عند RT لشطف محلول مضاد التجمد.
4. قم بإعداد محلول 0.5٪ من NaBH ₄ مخفف في PBS.
   1. تزن 0.05 جم من NaBH ₄ وقم بتخفيفها في 10 مل من PBS. لا تغطية. تحضير هذا الحل قبل الاستخدام مباشرة.
5. احتضان الأقسام في محلول NaBH ₄ المحضر حديثا لمدة 30 دقيقة في RT. صخرة برفق. لا تغطية.
6. اغسل 3x في PBS لمدة 10 دقائق في RT ، مع التأرجح بقوة حتى لا يتبقى أي من غاز التفاعل.
7. قم بإعداد محلول مانع ل EM مع مصل طبيعي مناسب بنسبة 2٪ و 0.5٪ جيلاتين سمك بارد مخفف في PBS.
   ملاحظة: يجب حساب الكمية من أجل الحصول على ما يكفي للخطوات الثلاث التالية. استخدم مصلا مصنوعا من نفس الأنواع الحيوانية التي تستضيف الجسم المضاد الثانوي. تجنب استخدام طرق استرجاع المستضد أو إضافة كميات صغيرة من التريتون (لزيادة تغلغل الأجسام المضادة) ، لأن هذه الطرق تضر بشكل كبير بجودة الأنسجة.
8. احتضان الأقسام في محلول الحجب لمدة 1 ساعة في RT. صخرة برفق.
9. تحضير محلول الأجسام المضادة الأولية المخفف في محلول الحظر.
   ملاحظة: عادة ما يكون تركيز الجسم المضاد الأساسي هو نفسه تركيز الكيمياء المناعية LM ، ولكن ضع في اعتبارك إجراء اختبارات بتركيزات مختلفة من الأجسام المضادة مسبقا ، حيث قد لا تعمل بعض الأجسام المضادة الأولية مع الأكرولين. إذا كان الأمر كذلك ، فمن الممكن استخدام مزيج من الجلوتارالديهايد (0.1 - 2٪) و 4٪ PFA للتروية عبر القلب والحصول على نتائج مماثلة. تحسين وقت الحضانة ودرجة الحرارة أيضا.
10. احتضان الأقسام في محلول الأجسام المضادة الأولية طوال الليل في RT مع هزاز لطيف. استخدم وقت ودرجة حرارة الحضانة التي تم اختبارها مسبقا.
11. اغسل الأقسام 3x في PBS لمدة 5 دقائق في RT مع هزاز لطيف.
12. قم بإعداد محلول 1: 1,000 من الجسم المضاد الثانوي البيوتينيل المخفف في محلول الحظر.
    ملاحظة: يجب رفع الجسم المضاد الثانوي ضد الأنواع المضيفة المستخدمة لتوليد الجسم المضاد الأساسي.
13. احتضان الأقسام في محلول الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1.5 ساعة في RT. صخرة برفق.
14. تحضير محلول أفيدين-بيوتين-بيروكسيداز (ABC) قبل 60 دقيقة على الأقل من نهاية حضانة الجسم المضاد الثانوي.
    1. استخدم ماصة معايرة لقياس 8.80 ميكرولتر/مل من المحاليل A وB وتخفيفها في PBS.
    2. صخور بشكل معتدل لمدة 60 دقيقة على الأقل في RT للسماح بالارتباط الكامل بين جزيئات أفيدين والبيوتين.
15. بعد الحضانة في محلول الجسم المضاد الثانوي ، اغسل 3x في PBS لمدة 10 دقائق في RT.
16. احتضان الأقسام في محلول ABC لمدة 1 ساعة في RT. صخرة برفق.
17. يغسل مرة واحدة في PBS ومرتين في TBS لمدة 10 دقائق في RT مع هزاز لطيف.
18. تحضير محلول طازج بنسبة 0.05٪ 3,3'-diaminobenzidine (DAB) مع 0.005٪ H₂O₂ مخفف في TBS.
    1. وزن 12.5 مجم من DAB وقم بتخفيفه في 25 مل من TBS البارد. الحماية من الضوء.
       تنبيه: مسحوق DAB شديد التطاير وضار إذا تم استنشاقه إنه مسرطن ومسامخ. وبالتالي ، يجب على النساء الحوامل أو المرضعات عدم التلاعب بهذا المنتج ، حتى عند تخفيفه. استخدم قناع N95 عند التلاعب وارتداء معدات الوقاية الشخصية.
    2. قم بتصفية المحلول وإضافة 4.5 ميكرولتر من 30٪ H₂O ₂ قبل الاستخدام مباشرة.
19. احتضان الأقسام في محلول DAB لمدة 3 إلى 7 دقائق في RT. صخرة برفق.
    ملاحظة: يجب ألا يكون الراسب البني داكنا جدا لتجنب مستوى عال من تلطيخ الخلفية. يجب تحسين وقت الحضانة وفقا لذلك.
20. أوقف التفاعل عن طريق الغسيل السريع مرتين في TBS البارد ، ثم مرتين لمدة 10 دقائق في TBS البارد في RT ، متبوعا مرتين لمدة 10 دقائق في PB ، مع هزاز خفيف.
    ملاحظة: يعد استخدام PB (وليس PBS) أمرا بالغ الأهمية من أجل القضاء على أي آثار لكلوريد الصوديوم ، لأنه سيتفاعل مع الأوزميوم ويشكل بلورات.

النتائج

الشكل 1: مخططات للخطوات الأساسية للبروتوكول. يتم تقطيع دماغ ( A ) إلى أقسام تسلسلية مع اهتزاز تبريد (B ). ثم تتم معالجتها لتضمين الكيمياء المناعية والفحص المجهر...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = 'collapse border: collapse ؛ font-family: Calibri ؛ حجم الخط: 11pt ؛ تخطيط الجدول: ثابت ؛ 'cellpacing = '0' cellpadding = '0' dir = 'ltr' border = '1' data-sheets root = '1' data-sheets basat = '1' >قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td style='border:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Dibasic Dibasic Lahydrous sodium phosphate Fisher Scientific< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;border-top:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>S374-500 < td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Monobased أحادي الهيدرات فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة EM ScienceSX0710-1 Sodium chloride (NaCl)Fisher ScientificS271-3 < td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;boardding:0px 3px;vertical-align:top;'>Hydroxymethyl aminomethane (THAM) Fisher ScientificT370-500 HCl EMDHX0603-31N dillution. المنتج أكال. استخدم مع الجرعة المناسبة.NaOHEMDSX0590-15N dillution. المنتج أكال. استخدم مع الحماية المناسبة.ParaformaldehydeSigmaP61484٪ dillution. المنتج شديد التقلب في شكل مسحوق وشديد السمية. استخدمه بحذر تحت غطاء التهوية مع الحماية المناسبة.Acrolein (90٪)sigma1102213٪ تخفيف. المنتج شديد السمية. استخدمه تحت غطاء التهوية مع الحماية المناسبة. autopsy تنفيس tableMopecCE400 <tr style='height:19px;'>< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Electronic perfusion pumpcole parmermasterflex L/S 7523-90 Needle (perfusion)terumo NN-1838R18G 1 1/2 needle< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;boardding:0px 3px;vertical-align:top;'>terumo NN-2713R< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>21G 1/2Ketamine 20 mg/kgXylazine < td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;boardding:0px 3px;vertical-align:top;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>4 mg/kgAcepromazine < td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #00000;overflow:hidden;boardding:0px 3px;vertical-align:top;'> 0.5 mg/kg< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Scalpel Scalpel blades Feather lance< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>201011 J9913No.22 للجراحة ورقم 11 ل EM< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Surgical Scissors< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> Rongeurs < td style='border-bottom:1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>VibratomeLeicaVT 1200S< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;boardding:0px 3px;vertical-align:top;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'> Calibrate Blade قبل كل استخدام، عندما يسمح الجهاز بذلكVibratome razor bladeGillette< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>GIN 642107 GlycerolFisher-ScientificG33-4< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>30٪ تخفيفEthylene glycol Fisher ScientificE178-430٪ dilution< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Sodium borohydridesigmaS-9125 Normal horsehorse serumJackson immunoResearch Laboratories008-000-1212٪ dilution='height:19px;'> جيلاتين السمك البارد< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;boardding:0px 3px;vertical-align:top;'>Aurion900.033 Primary Antibody ، SERT < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: top ؛ '> سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;boardding:0px 3px;vertical-align:top;'>SC-14581/500 dillution< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Primary Antibody, ChATChemicon (Millipore)AB144P1/25 dillution Primary antibody , THImmunoStar229411/1000 dilutionbody المضاد الثانوي البيوتينيليت ، الماعزVector-LaboratoriesBA-9500< td style='border-bottom: 1px solid #000000؛ border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;s-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>1/1000 difltionbody-entry dual biotinylated on, mouse Vector laboratories< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>BA-20001/1000 dilutionVectastain elite ABC kitVector laboratories< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>PK61008.8 μL/mL من A و B لكل منهما< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>3'3diaminobenzidine (DAB)SigmaD56370,05٪ تخفيف. المنتج شديد التقلب في شكل مسحوق وسام. لا ترمي النفايات في الحوض.peroxide 30٪ Fisher ScientificH-3230,005٪ تخفيف