تلطيخ الأنسجة الهيستوكيميائية المناعية للعمليات البردية للأنسجة الإكليلية للفئران للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية

الملخص

المصدر: Evilsizor, M. N., et. al. ، التمهيدي للكيمياء المناعية على أنسجة دماغ الفئران المقطوعة بالتبريد: مثال على تلطيخ الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو إجراء تلطيخ الكيمياء المناعية خطوة بخطوة على أنسجة دماغ الفئران التي تم قطعها بالتبريد لتصور الترتيب المكاني للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية للحيوانات المناسبة.

1. Tissue Staining
   1. في صندوق تلطيخ محكم الغلق، قم بإنشاء "غرفة رطوبة" بمناديل خالية من النسالة مبللة بالماء منزوع الأيونات.
   2. جفف حواف الشريحة بمنديل خال من النسالة، واستخدم قلم عنق الرحم الصغير لعمل حدود طاردة للسوائل عند حافة الشريحة، بعيدا عن أقسام الأنسجة. يجب أن تضمن هذه الحدود مساحة واسعة بين الغضروف المفصلي للسائل وحافة الأنسجة حتى لا يؤثر التوتر السطحي على تلطيخها.
      NOTE: يمكن تطبيق حدود طارد قلم عنق الرحم قبل 1.1.3 إذا كانت الأجسام المضادة ذات الأهمية لا تتطلب استرجاع مستضد الميكروويف. إذا تم تطبيق قلم عنق الرحم قبل الغسيل في PBS ، فيجب التحقق من سلامة حدود طارد السوائل في هذه الخطوة. استخدم قلم عنق الرحم المصغر لملء أي فجوات في الحدود.
   3. مع وضع الشرائح أفقيا، قم بمنع ارتباط المستضد غير المحدد عن طريق احتضان مصل 4٪ v / v في PBS (محلول كتلة). الماصة 300 ميكرولتر من محلول البلوك لكل شريحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن محلول الكتلة يمتد إلى قلم عنق الرحم على حافة الشريحة ويغطي الأنسجة بالكامل لتجنب البقع غير المتساوية الناتجة عن التوتر السطحي بالقرب من الأنسجة.
      1. استخدم المصل من نفس النوع الذي يصنع فيه الجسم المضاد الثانوي. ملاحظة: في هذا الإجراء ، يتم صنع الأجسام المضادة الثانوية في الحمار ، وبالتالي يتم استخدام مصل الحمار. إذا تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية من نوعين مختلفين أو أكثر، فقم بتضمين مصل من كل نوع.
   4. piette primary antibody on slaimate. ملاحظة: تم تحسين تركيزات الأجسام المضادة لهذا التلوين عند 1: 5,000 و 1: 500 ل Iba1 و Pan-neuronal ، على التوالي. تم العثور على هذه التركيزات لإظهار تلطيخ ذي مغزى دون تلطيخ الخلفية.
      1. تمييع محلول الكتلة إلى مصل 1٪ في PBS وإضافة الأجسام المضادة الأولية. ماصة 300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية في مصل 1٪ لكل شريحة. مرة أخرى ، تأكد من أن السائل على حافة قلم عنق الرحم. احتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
      2. include three clists: واحدة لا تحتوي على Iba1 أو الأجسام المضادة العمومية العصبية، واحدة تحتوي على Iba1 بدون جسم مضاد عمومي للخلايا العصبية، وواحدة تحتوي على جسم مضاد عموم الخلايا العصبية بدون Iba1. قم بتلطيخ هذه الشرائح في نفس المسار بنفس الحلول ، ولكن احذف الأجسام المضادة الأولية لاختبار الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة الثانوية.
   5. في صباح اليوم التالي، اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما، مع تغيير المحلول بين الغسل.
   6. الأجسام المضادة الفلورية حساسة للضوء، وبالتالي، من هذه الخطوة إلى الأمام، قلل من التعرض للضوء من خلال ضمان تغليف حاويات الغسيل بورق الألمنيوم وصناديق التهجين إما سوداء أو محتضنة في الظلام. ماصة الأجسام المضادة الثانوية المناسبة على جميع الشرائح وتحتضن لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بتركيز 1: 250 في محلول الكتلة (انظر الخطوة 1.2.3) في "غرفة رطوبة" محكمة الغلق (انظر الخطوة 1.2.1).
      1. استخدم أجساما مضادة ثانوية ذات أطوال موجية مختلفة. هنا ، بالنسبة للأرنب المضاد الأساسي للأرانب المضاد ل Iba1 ، استخدم الحمار المضاد للأرانب 594 كجسم مضاد ثانوي مناسب. بالنسبة للجسم المضاد الأساسي للفأر المضاد للخلايا العصبية ، استخدم الحمار المضاد للفأر 488 كجسم مضاد ثانوي مناسب. بدلا من ذلك ، استخدم مضاد للأرانب 488 ومضاد للفأر 594.
   7. اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة 5 دقائق لكل منها.
   8. اختياري: إجراء تلطيخ نووي.
      1. ضعه في Hoechst (أو بقعة نووية أخرى) بتركيز 0.03 ميكروغرام/مل في نمط H='لون الخلفية:شفاف;اللون:#00000;'>₂O لمدة 60 ثانية بالضبط.
      2. اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة 5 دقائق لكل منها.
   9. Wash in ddH₂O.
2. Coverslipping
   1. Coverslip slides with medium mount water, مثل Fluoromount-G أو ProlongGold. احرص على إزالة جميع الفقاعات باستخدام قضيب قطني.
      ملاحظة: يمكن استخدام عوامل تركيب أخرى، ولكن لاحظ البعض حدوث نزيف عال بين الأصباغ في غضون أيام من الغطاء.
   2. استخدم طلاء أظافر شفاف لإغلاق الحواف، مما يمنع الأقسام من الجفاف بسبب التبخر. اتركي طلاء الأظافر يجف في وعاء محكم الغلق بينما تظل الشرائح مسطحة وفي درجة حرارة الغرفة ، ثم خزنيها في وعاء محكم الغلق ملفوف بورق الألمنيوم عند 4 درجات مئوية.

المواد

<فئة الشكل = نمط الجدول = 'العرض: 920pt ؛ '>< فئة الجدول = 'ck-table-resize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td style = 'الارتفاع: 15.5pt ؛ العرض: 230pt ؛ '>اسم المادة / المعدات < td style = 'العرض: 230pt ؛ '> < td style = 'width: 230pt ؛ '> Fisherbrand Superfrost بالإضافة إلى الشرائح الزجاجية < td style = 'العرض: 230pt ؛ '> Fisher Scientific < td style = 'width: 230pt ؛ '> 22-034-979 < td style = 'width: 230pt ؛ '> تستخدم لتركيب الأنسجة < td style = 'الارتفاع: 15.5pt ؛ العرض: 230pt ؛ '>Oven < td style = 'width: 230pt ؛ '>Thermo Scientific < td style = 'width: 230pt ؛ '>51028112 < td style = 'width: 230pt ؛ '> يستخدم لتجفيف الأنسجة < td style = 'height: 15.5pt ؛ width: 230pt ؛ '> Mini Pap Pen < td style = 'width: 230pt ؛ '>Life Technologies00-8877 Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining DishFisher Scientific22-149-429تستخدم لجميع عمليات الغسيل أثناء التلوين، بالإضافة إلى خطوة Hoechst Kimwipes< td style='width:230pt;'>Fisher Scientific06-666-Aيستخدم لتجفيف الشرائح Black Staining BoxTed Pella21050used for block and stain steps Normal Donkey SerumFisher علمي50-413-253used for block and antibody inbutationMouse α-Pan-neuronalMilliporeMAB2300used for primary antibody antibody Rabbit α-Iba1Wako Chemical019-19741used for primary antibody antibody Donkey α-Rabbit 594Jackson ImmunoResearch711-585-152used for secondary antibody Donkey α-mouse 488Jackson ImmunoResearch715-545-150 يستخدم للأجسام المضادة الثانوية < td style = 'الارتفاع: 15.5pt ؛ العرض: 230pt ؛ '>Fluoromount-G < td style = 'width: 230pt ؛ '>Southern Biotech < td style = 'width: 230pt ؛ '> 0100-01 < td style = 'width: 230pt ؛ '> used for coverslipping CoverslipsFisher Scientific < td style = 'width: 230pt ؛ '> 12544Eيستخدم للغطاء< td style = 'الارتفاع: 31.0pt ؛ العرض: 230pt ؛ '>Axio Observer.Z1 و LSM 710 (المسح بالليزر ، المسح الضوئي) < td style = 'العرض: 230pt ؛ '>Carl Zeiss < td style = 'width: 230pt ؛ '>N / A < td style = 'width: 230pt ؛ '>used for imagingAxioskop A2 Carl Zeiss < td style = 'width: 230pt ؛ '>N / A < td style = 'width: 230pt ؛ '> يستخدم للتصوير